日本血吸虫pcDNA3/SjCWL01核酸疫苗的构建及其对小鼠免疫效果观察

目的构建日本血吸虫pcDNA3/SjCWL01核酸疫苗并进行免疫保护效果观察,评价其作为疫苗的潜能。方法将日本血吸虫基因SjCWL01亚克隆入真核表达载体pcDNA3,构建目的基因真核表达质粒,将pcDNA3/SjCWL01质粒转化大肠杆菌DH5α,大量制备DNA疫苗并免疫小鼠3次,间隔2w,末次免疫后2w,用ELISA法检测免疫鼠血清特异性抗体效价,日本血吸虫尾蚴进行腹部皮肤攻击感染,感染后45d剖杀冲虫,分别计算减虫率,每克肝、粪卵减少率。结果重组DNA疫苗(pcDNA3/SjCWL01)与对照组比较,虫荷、每克肝卵、每克粪卵数分别下降了27.6%,39.5%,45.9%。结论表明pcD-NA3/SjCWL01疫苗可诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力。     

日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗与IL-4真核表达质粒联合免疫诱导小鼠保护性的研究

目的　观察日本血吸虫组织蛋白酶BDNA疫苗与IL 4真核表达质粒联合免疫小鼠的效果。　方法　将小鼠IL 4基因PCR扩增片段克隆入真核表达载体pcDNA3以构建重组表达质粒。小鼠分为 4组 ,每组 12只 ,实验组 (A)每鼠肌注组织蛋白酶BDNA疫苗和IL 4表达质粒各 10 0 μg ,同时设立组织蛋白酶BDNA疫苗对照组 (B)、IL 4表达质粒对照组 (C)和空载体对照组 (D) ,共免疫 3次。 2周后用免疫组化检测表达质粒在小鼠肌细胞的表达 ,3周后经皮肤攻击感染小鼠 40± 1条日本血吸虫尾蚴。计算减虫和减卵率 ,观察免疫保护性。　结果　重组IL 4质粒和组织蛋白酶BDNA疫苗均在小鼠肌细胞表达。用重组IL 4质粒和组织蛋白酶BDNA疫苗联合免疫诱导小鼠产生 43 .2 0 %的减虫率和 76.63 %的减卵率 ,与组织蛋白酶BDNA疫苗单独免疫比较差异均有显著性 (P <0 .0 0 1,P <0 .0 5 )。　结论　联合IL 4表达质粒免疫可能提高日本血吸虫组织蛋白酶BDNA疫苗的抗血吸虫保护性免疫。     

日本血吸虫核糖体蛋白SjRPS4、SjRPL7 DNA疫苗对小鼠免疫保护作用研究

目的研究日本血吸虫核糖体蛋白SjRPS4、SjRPL7DNA疫苗对小鼠免疫保护作用。方法大量制备pcD-NA3.0/SjRPS4和pcDNA3.0/SjRPL7质粒DNA疫苗,昆明小鼠40只,随机均分为A、B、C和D组,A组为生理盐水(NS)组,每次肌肉注射100μL生理盐水;B组每只小鼠的股四头肌注射100μgpcDNA3.0裸质粒DNA;C组为pcDNA3.0/SjRPS4真核重组质粒组,每次肌肉注射质粒100μg/100μL;D组为pcDNA3.0/SjRPL7真核重组质粒组,每次肌肉注射质粒100μg/100μL。每隔2w同量加强免疫1次,共3次。末次免疫后第2w测定免疫各组血清特异性抗体效价后,经小鼠腹部皮肤人工感染20±1条日本血吸虫尾蚴。感染后第42d处死小鼠,计算减虫率和减卵率。结果与NS对照组比较,pcDNA3.0/SjRPS4和pcDNA3.0/SjRPL7免疫组小鼠均获得了较显著的减虫率、肝减卵率、肠减卵率、每雌子宫减卵率。统计学处理,均有显著性差异。结论pcDNA3.0/SjRPS4和pcDNA3.0/SjRPL7DNA疫苗对小鼠均有较强的免疫保护效果。     

日本血吸虫P14基因纳米微球-DNA疫苗的免疫保护作用

目的 探讨日本血吸虫碱性调宁蛋白样蛋白P14基因的重组真核表达载体(pcDNA3.1(+)-SjP14)对小鼠血吸虫感染的免疫保护作用.方法 制备无内毒素pcDNA3.1 (+)-SjP14及纳米微球DNA疫苗,将雌性BALB/c小鼠随机分为3组,每组10只,分别为生理盐水对照组、pcDNA3.1(+)-Sj P14组及纳米微球-DNA疫苗组.各组小鼠分别肌肉注射生理盐水和pcDNA3.1(+)-Sj P14、纳米微球DNA疫苗100μg/鼠·次,每2周免疫一次,共3次.末次免疫后2周,尾蚴攻击,6w后处死小鼠,收集成虫,计算减虫率;同时留取肝脏,部分消化后在显微镜下行虫卵计数,计算减卵率.结果 pcDNA3.1(+)-Sj P14p核酸疫苗能明显提高小鼠的抗血吸虫感染能力,减虫率和减卵率分别达到44.6％和61.6％;纳米微球-DNA疫苗免疫能进一步提高小鼠抗血吸虫感染作用,减虫率和减卵率分别提高至56.2％和73.5％.结论 pcDNA3.1(+)-Sj P14核酸疫苗有一定程度的抗血吸虫感染作用,pcDNA3.1(+)-SjP14-纳米微球复合物疫苗免疫能增强小鼠对血吸虫感染的免疫保护作用.     

重组白细胞介素-4增强日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗诱导小鼠的保护力

目的?摇探讨重组白细胞介素－4（IL-4）真核表达质粒增强日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗对小鼠的免疫保护效果。 方法 将小鼠IL-4 基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1以构建小鼠重组IL-4表达质粒， 并联合日本血吸虫组织蛋白酶B的表达质粒DNA (VR1012-Sj31)肌注免疫小鼠，设重组IL-4表达质粒、组织蛋白酶B表达质粒和2种空载体质粒对照组。免疫组化检测IL-4和组织蛋白酶B在小鼠肌细胞内的表达，末次免疫3周后攻击感染，用减虫率及减卵率表示保护力。 结果 重组IL-4和组织蛋白酶B DNA均在小鼠肌细胞表达，重组IL-4和组织蛋白酶B DNA联合免疫小鼠，产生43.2% 的减虫率和76.6% 的减卵率，与组织蛋白酶B DNA单独免疫相比差异有显著性（P<0.01，P<0.05 ）。 结论 重组IL-4 能提高日本血吸虫组织蛋白酶B 核酸疫苗的抗血吸虫保护力作用，具有佐剂的免疫效应。     

日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区cDNA核酸疫苗的研究

目的　为研究血吸虫性别特异性表达基因的核酸免疫特性。方法　本研究将所克隆的编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因保守区cDNA片段克隆到真核表达载体 pcDNA3中 ,得到的重组质粒直接免疫昆明系小鼠 ,感染血吸虫尾蚴 ,7周后剖杀小鼠冲虫 ,进行成虫和虫卵计数。结果　其减虫率为 32 4 % ,肝脏减卵率为 4 6 9% ,与对照组比较差异显著。结论　初步显示血吸虫抱雌沟蛋白基因DNA疫苗具有一定的核酸免疫保护功能     

日本血吸虫新基因Sj Dad1的DNA免疫动物保护性实验研究

目的　观察日本血吸虫未知基因SjDad1的DNA免疫保护动物实验效果 ,探讨其作为疫苗候选分子的可能性。方法　构建SjDad1的真核表达载体 pEGFP -N3 -SjDad1,两次质粒DNA免疫BALB/c小鼠后给予小鼠日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,设置生理盐水对照组 (NS)和pEGFP -N3 对照组 ,攻击感染后 4 2天处死小鼠 ,计算减虫率和减卵率。结果　双酶切和PCR反应以及测序结果证实重组真核表达载体 pEGFP -N3 -SjDad1构建成功 ,DNA免疫动物的保护实验证明 pEGFP -N3 -SjDad1与生理盐水组相比对小鼠没有显著的减虫作用 (P >0 0 5 ) ,减卵效果具有显著性意义 (P <0 0 1) ,减卵率是6 5 74 %。结论　日本血吸虫 pEGFP -N3 -SjDad1有抗血吸虫生殖作用 ,具有疫苗研究开发价值。     

日本血吸虫混合DNA疫苗免疫效果观察

目的 为提高日本血吸虫DNA疫苗免疫效力,观察日本血吸虫抗原分子的混合DNA疫苗诱导小鼠的抗攻击感染的保护性免疫。方法 大量制备真核质粒pBK-CMV-Sj26和pBK-CMV-Sj23,然后将单价DNA疫苗pBK-CMV-Sj26和pBK-CMV-Sj23混合后免疫小鼠。实验分为4组：混合疫苗组、单价疫苗pBK-CMV-Sj23组、空质粒对照组及生理盐水对照组。各组于0周、3周、5周在小鼠股四头肌注射相应质粒DNA或生理盐水,第9周小鼠用血吸虫尾蚴攻击感染,第15周剖杀小鼠计算减虫率及减卵率。结果 与对照组比较,实验组小鼠减虫率及减卵率有极显著性意义（P＜0．01）;与单价pBK-CMV-Sj23组比较,混合DNA疫苗组的减虫率及减卵率有显著性意义（P＜0．05）。结论 血吸虫混合DNA疫苗诱导小鼠对血吸虫的保护力优于单价DNA疫苗。     

日本血吸虫体表蛋白Tetraspanin 2-A核酸疫苗的构建及其对小鼠的免疫试验

采用PCR法扩增日本血吸虫体表四跨膜家族蛋白2-A（SjTsp2-A）基因,构建重组质粒pcDNA3.1（+）/SjTsp2-A,将其转至大肠埃希菌DH5α制备DNA疫苗pcDNA3.1（+）/SjTsp2-A。24只BALB/c小鼠均分3组,每鼠于左股四头肌注射0.5 mg/ml盐酸布比卡因50 μl。次日,A组同法注射DNA疫苗pcDNA3.1（+）/SjTsp2-A,B组注射重组质粒pcDNA3.1（+）/SjGST,C组注射空质粒pcDNA3.1（+）。注射剂量均为100 μg/只。每隔2周注射1次,共3次,末次免疫后2周各组均经腹部皮下感染日本血吸虫尾蚴40±2条/鼠,45 d后剖杀,计数减虫率和减卵率。ELISA检测抗体效价,A组化分析股四头肌局部组织蛋白表达情况。结果A组的平均检虫数和每克肝组织虫卵数均显著低于B组和C组（P值均<0.05）,A组的减虫率和减卵率分别为44.4%和28.4%。A组血清抗体效价高达1 ∶ 25 600。A、B两组局部组织均有特异性蛋白表达。DNA候选疫苗pcDNA3.1（+）/SjTsp2-A能诱导小鼠产生一定的免疫保护作用。     

血吸虫硫氧还蛋白免疫原性研究Ⅱ日本血吸虫硫氧还蛋白DNA疫苗小鼠保护性免疫研究

目的观察日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx)在小鼠诱导抗血吸虫感染的免疫保护作用。方法制备pcDNA3-SjcTrx重组质粒,将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为3组,每组10只:pcDNA3-SjcTrx核酸疫苗免疫组、pcDNA3空质粒对照组和攻击感染对照组。核酸疫苗免疫组每只小鼠经股四头肌注射100μg核酸疫苗,共注射3次,间隔2周。空质粒对照组每只小鼠在相应时间经股四头肌注射100μgpcDNA3空质粒,感染对照组则不注射任何质粒。于末次免疫后3周,每只小鼠经腹部感染(30±1)条日本血吸虫尾蚴。小鼠于攻击感染后42天剖杀,门脉灌注收集成虫,计数成虫数和肝内虫卵数。分别在免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前采血并分离血清,用ELISA检测血清中特异性IgG抗体。另取6只雌性C57BL/6小鼠经股四头肌注射核酸疫苗,分别于注射后24、48小时和72小时取肌肉注射部位局部组织制备冰冻切片,用免疫酶染色试验(IEST)检测注射局部组织抗原的表达情况,以注射pcDNA3空质粒者为对照。结果IEST结果表明该DNA疫苗在小鼠肌肉组织内表达,ELISA检测表明DNA疫苗免疫小鼠后产生明显的抗体(IgG)免疫应答,并诱导出对攻击感染的45.7%的减虫率和41.4%的肝组织减卵率(P<0.05)。结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗具有较好的免疫原性,在小鼠诱导出明显的免疫保护作用,可作为疫苗候选分子作进一步的研究。     

血吸虫硫氧还蛋白免疫原性研究Ⅰ日本血吸虫硫氧还蛋白DNA疫苗的构建和鉴定

目的构建日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白(Trx)DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx),并进行分子生物学鉴定。方法根据日本血吸虫菲律宾株Trx基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入EcoRI酶切位点和终止密码子TCA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株Trx(SjcTrx)编码基因。经双酶切并纯化的PCR产物与经双酶切纯化的pcDNA3质粒DNA片段用T4DNA连接酶连接,克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-SjcTrx,并经限制性内切酶双酶切、琼脂糖凝胶电泳、PCR检测和核苷酸序列测定进行鉴定。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334bp,构建的pcDNA3-SjcTrx重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段,根据核苷酸序列测定结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗构建成功,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

日本血吸虫三磷酸甘油醛脱氢酶核酸疫苗小鼠体内的免疫应答特征

目的 研究日本血吸虫大陆株三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠诱生的免疫应答特征和保护性。 方法 将用免疫筛库得到的日本血吸虫大陆株GAPDH编码基因以PCR扩增，扩增产物T-A克隆至载体pT-Adv而后与真核表达载体pcDNA3连接，构建成核酸疫苗（pcDNA3-SjGAPDH）。将纯化的pcDNA3-SjGAPDH经后腿胫前肌免疫C57BL/6小鼠。免疫荧光染色法研究pcDNA3-SjGAPDH在注射的局部肌肉表达特性；用十二烷基硫酸钠?鄄聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）、蛋白质印迹法（Western blotting）、ELISA等方法分析pcDNA3-SjGAPDH所诱导的特异性免疫应答特征。 结果 pcDNA3-SjGAPDH免疫后24和48h即可在荧光显微镜下看到C57BL/6小鼠小腿胫前肌的局部肌肉的冰冻切片发出淡绿色荧光，表明有GAPDH蛋白的表达。pcDNA3-SjGAPDH免疫小鼠主要诱生IgG2a、IgG2b和IgG3亚类；免疫小鼠脾淋巴细胞体外经特异性抗原刺激主要诱生γ-干扰素(IFN-γ)和白介素-2(IL-2)细胞因子，未检出IL-4。另外，免疫鼠血清能够识别日本血吸虫SWAP中的天然GAPDH成分。 结论 pcDNA3-SjGAPDH核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠主要诱导Th1类型细胞免疫应答。     

细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的　克隆Eg95抗原基因 ,构建携带目的基因的真核表达载体 ,为细粒棘球蚴DNA疫苗的研究提供材料。方法　应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因 ,将其克隆至 pUCm -T载体 ,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上 ,根据选择标记的氨苄抗性基因筛选到阳性克隆 ,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序确定序列。结果　测序表明所选 pcDNA3-Eg95阳性克隆均为正确连接Eg95抗原基因的重组质粒 ,可以作为DNA疫苗作进一步的研究。结论　成功构建真核细胞表达载体 pcDNA3-Eg95。     

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫力的研究

目的构建日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)重组质粒,并观察其在小鼠体内诱导的抗日本血吸虫感染保护作用。方法RT-PCR特异性扩增Sj14FABP基因,将其克隆入真核表达载体pVIVO2,通过PCR、双酶切及测序鉴定。获得的重组质粒pVIVO2-Sj14FABP转染HepG2细胞,间接免疫荧光(IFA)检测蛋白表达;并免疫BALB/c小鼠,30d后攻击感染,感染后45天剖杀,计数检获成虫数和肝脏虫卵数。结果RT-PCR扩增出大小为440bp的Sj14FABP片段,重组质粒经PCR和双酶切后均获得目的片段,转染细胞IFA结果显示有较强荧光。重组质粒免疫小鼠后分别获得24.1%减虫率和27.2%减卵率。结论成功构建和表达重组质粒pVIVO2-Sj14FABP,该核酸疫苗能够诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力。     

日本血吸虫再感染相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的　从日本血吸虫 (S .japonicum )尾蚴文库扩增S .japonicum再感染相关蛋白 (RIRP)基因 ,进行克隆并原核表达出RIRP ,为进一步的功能研究奠定基础。　方法　根据已登陆的S .japonicum成虫期RIRP基因的序列设计两条特异引物 ,以S .japonicum尾蚴cDNA文库为模板扩增RIRP基因cDNA ,将该基因的cDNA克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1和真核载体 pcD NA3 .1。转化的克隆通过氨苄青霉素的筛选、PCR扩增、双酶切和最后的测序鉴定。重组的 pGEX 4T 1/RIRP在大肠埃希菌BL2 1(DE3 )中进行表达。SDS PAGE鉴定其在大肠埃希菌中的表达情况和分子质量。用抗 2 6kuGST单抗作western杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。　结果　从S .japonicum尾蚴文库中扩增出一条长为 462bp的cDNA片段 ,经测序证实其为RIRP基因的全长cDNA。它编码含 15 3个氨基酸的蛋白质—RIRP ,预测其分子质量单位为 17.5 45ku。RIRPcDNA已被成功克隆入 pGEX 4T 1和pcDNA3 .1载体 ,大肠埃希菌BL2 1(DE3 )编码一个约 17ku的蛋白质。　结论　RIRP基因首次从S .japonicum尾蚴文库中扩增出来 ,并成功构建了原核和真核表达载体 ,而且 ,它首次由大肠埃希菌表达 ,表达蛋白的分子质量单位约 17ku。