利用基因芯片分析碱性成纤维细胞生长因子诱导脐血干细胞CD34~+与CD133~+细胞基因表达的差异

背景:迄今为止,人们利用基因芯片对碱性成纤维细胞生长因子诱导CD34~+和CD133~+干细胞分化后细胞生物学性状、功能调控、基因变化及其表达差异等方面的认识尚不足,有待深入研究.目的:利用基因芯片比较脐血CD34~+和CD133~+细胞基因表达的差异,并探讨碱性成纤维细胞生长因子体外诱导脐血CD34~+和CD133~+造血干/祖细胞分化的基因表达变化,及其对碱性成纤维细胞生长因子反应性差异.方法:利用MiniMACS免疫磁珠法从脐静脉血单个核细胞中分离出CD34~+和CD133~+干/祖细胞,经含碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM/F12细胞营养液培养10～15 d,提取培养前后细胞总RNA,利用Oligo GEArray(r)芯片和GEArray表达分析软件进行芯片数据分析.流式细胞仪检测CD34~+和CD133~+造血干细胞回收率.碱性成纤维细胞生长因子诱导前后CD34~+、CD133~+细胞形态变化.变性琼脂糖凝胶电泳测定RNA浓度和纯度.基因芯片检测结果.结果与结论:①对20份脐血分别进行CD34~+和CD133~+细胞分选,分选CD34~+细胞纯度为(77.52±5.06)%,回收率为(2.74±1.59)%;CD133~+细胞纯度为(79.16±3.37)%,回收率为(1.12±0.94)%.②新分选出的CD34~+细胞呈球形,经碱性成纤维细胞生长因子培养15 d后,多数细胞形态未发现显著变化,部分细胞出现贴壁生长,可见突起和梭形细胞.CD133~+细胞呈球形,经碱性成纤维细胞生长因子培养15 d后,细胞明显扩增,由圆球形变为不规则形,部分细胞出现贴壁生长.③CD34~+干细胞培养前后总RNA提取质量分别为2 236 ng和1 796 ng;CD133~+干细胞培养前后总RNA提取质量分别为2 518 ng和2 191 ng.④在所检测的263个干细胞相关基因中,脐血CD133~+细胞与CD34~+细胞基因表达差异2倍以上的基因有10种,其中5种基因表达前者高于后者,5种基因表达前者低于后者;碱性成纤维细胞生长因子诱导培养后,CD133~+细胞有32种基因表达显著高于CD34~+细胞,在检测的263个基因中,未见低于CD34~+细胞的基因.证实脐血中新分离的CD133~+细胞和CD34~+细胞基因表达仅有少数基因存在差异;CD133~+细胞对碱性成纤维细胞生长因子的反应性显著强于CD34~+细胞,表现为细胞周期调节、信号转导和分化等基因表达增强.     

人脐血造血干/祖细胞体外定向诱导分化过程中端粒酶的表达

探讨脐血造血干/祖细胞体外诱导分化过程中端粒酶的表达,为造血干细胞产品的临床应用提供一个监测细胞增殖潜能和安全性的指标。用源自人脐血的CD34~+细胞及不同细胞因子组合(SCF+IL-3+IL-6+G-CSF,SCF+IL-3+IL-6+EPO)在体外进行诱导分化;用TRAP聚丙烯酰胺凝胶电泳法、TRAP-ELISA法检测CD34~+细胞及诱导分化细胞的端粒酶活性;用Western印迹法在蛋白水平检测端粒酶催化亚基hTERT的表达,用RT-PCR在细胞转录水平检测端粒酶催化亚基hTERT mRNA的表达。结果显示,在体外诱导分化14-21天为细胞生长峰值,细胞总数可增加(1006.4±103.2)倍,随着培养时间的延长,细胞数量不再增加。CD34~+细胞低度表达端粒酶活性和hTERT基因,在细胞诱导分化过程中端粒酶活性及hTERT表达逐渐升高,细胞诱导14天后端粒酶活性及hTERT表达下降,28天端粒酶活性及hTERT基因检测不出。结论:利用CD34~+细胞在体外定向诱导分化出的大量细胞,不具有无限增殖的特性,可安全地应用于临床,且利用端粒酶的检测可为临床应用诱导分化细胞的时机提供依据。     

人脐血CD133+和CD133-细胞分化为内皮细胞的实验研究

目的从人脐血中分离鉴定、培养和诱导分化人脐血CD133+细胞和CD133-细胞,建立一种能够方便获得高纯度人脐血CD133细胞的方法,同时在体外诱导该细胞向内皮细胞分化,进一步明确CD133+细胞与CD133-细胞之间的关系.方法从新鲜脐血中纯化的CD133+和CD133-接种于添加了干细胞因子(stem cellfactor,SCF),IL-3,IL-6的Sigma无血清培养液中,检测CD133+细胞抗原标志,观察梭形贴壁细胞的出现时间和特异性细胞标志.结果免疫磁珠法分离的CD133+细胞数为(6.08～6.80)×105,CD133+细胞的纯度(96.18±1.83)%.CD133-细胞(0.02±0.01)%.培养3～5 d可观察到梭形贴壁细胞,15d左右可形成索条状结构,贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志血管内皮钙黏蛋白,血浆血管性假性血友病因子(von Willebrandfactor,vWF),UEA-1和血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growthfactor receptor-2,VEGFR-2).结论采用先用密度梯度离心法离心后再用免疫磁珠分选的方法来分离CD133+细胞和CD133-细胞,分离到的细胞纯度高,在一定的条件下,可分化为内皮样细胞.     

细胞因子体外诱导脐血CD34+细胞增殖并向巨核细胞/血小板分化的研究

本研究旨在观察几种不同细胞因子组合通过体外培养以诱导造血干/祖细胞增殖和向巨核细胞/血小板分化.应用无血清培养基(StemSpan SFEM)体外扩增脐血CD34+细胞并向巨核细胞/血小板定向分化,将不同细胞因子组合分为3个阶段培养,并比较其培养效果.结果表明,在第一阶段的第14天时,SCF + TPO + FL + ...     

脐血间充质干细胞的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血间充质干细胞(MSC)的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法用液体培养法分离脐血贴壁细胞,采用ELISA方法检测贴壁细胞条件培养液中细胞因子的表达;用流式细胞术分析其免疫表型特征;在成软骨细胞诱导培养条件下诱导细胞分化,并用RTPCR方法检测分化后细胞原胶原Ⅱ型基因的表达。采用分阶段共培养方法观察脐血贴壁细胞对CD34+细胞体外扩增的支持作用。结果脐血单个核细胞纤维样细胞集落形成率为(3.5±0.7)/106。脐血MSC体外至少可以扩增15代。没有分化的脐血MSC表型为CD13、CD29、CD90、CD105、CD166、SH2、SH3和SH4阳性,CD45、CD34和CD14阴性;脐血MSC培养上清中干细胞因子、IL6和肿瘤坏死因子α检测阳性。在成软骨细胞诱导培养基培养条件下,脐血MSC原胶原Ⅱ型基因mRNA表达阳性。脐血MSC与CD34+细胞共掊养14d,CD34+细胞扩增率高于未共培养组4倍。结论脐血MSC具有类似于成体骨髓MSC的特征,对造血干细胞增殖有明显的支持作用。     

人脐血CD133^＋和CD133^-细胞分化为内皮细胞的实验研究

目的：从人脐血中分离鉴定、培养和诱导分化人脐血CD133^+细胞和CD133^+细胞，建立一种能够方便获得高纯度人脐血CD133细胞的方法，同时在体外诱导该细胞向内皮细胞分化，进一步明确CD133^+细胞与CD133^-细胞之间的关系。方法：从新鲜脐血中纯化的CD133^+和CD133^-接种于添加了干细胞因子(stem cell factor，SCF)，IL-3，IL-6的Sigma无血清培养液中，检测CD133^+细胞抗原标志，观察梭形贴壁细胞的出现时间和特异性细胞标志。结果：免疫磁珠法分离的CD133^+细胞数为(6．08—6．80)&;#215;105，CD133^+细胞的纯度(96．18&;#177;1．83)％。CD133^-细胞(0．02&;#177;0．01)％。培养3—5d可观察到梭形贴壁细胞，15d左右可形成索条状结构，贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志血管内皮钙黏蛋白，血浆血管性假性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)，UEA-1和血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor eceptor-2，VEGFR-2)。结论：采用先用密度梯度离心法离心后再用免疫磁珠分选的方法来分离CD133^+细胞和CD133^-细胞，分离到的细胞纯度高，在一定的条件下，可分化为内皮样细胞。     

人脐血间充质干细胞的体外成骨

背景:用免疫细胞阴性筛选法可以排除造血干细胞对于间充质干细胞生长的影响,较快的获得具有表达间充质干细胞的细胞群。目的:探讨人脐静脉血间充质干细胞向成骨样细胞分化的能力。方法:用免疫磁珠阳性筛选法分离脐血间充质干细胞后进行培养。取P2代细胞行成骨诱导分化。结果与结论:人脐血间充质干细胞贴壁生长,长梭形,3周长满瓶底,传代后细胞增殖迅速。细胞表型为高表达CD44+,CD29+和CD166+。在成骨诱导后碱性磷酸酶染色阳性,Von-Kossa染色提示钙化结节形成。提示脐血间充质干细胞能够在体外分化为成骨样细胞。     

脐带间充质干细胞对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响

背景:体外扩增是目前解决脐带血干细胞移植所面临的单份脐血造血干祖细胞数不足问题的丰要手段.已有许多关于不同来源的间充质干细胞联合不同细胞因子支持脐血造血干祖细胞体外扩增的报道,而单独应用间充质干细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增的报道仍很少.目的:观察应用脐带源间充质干细胞作基质层的体外培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用.设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-03/2007-05在中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所、实验血液学国家重点实验室完成.材料:经产妇知情同意,采集健康足月分娩胎儿脐带9份.方法:应用贴壁培养的方法从正常足月出生儿脐带中分离培养间充质干细胞,通过细胞形态学、免疫表型、分化实验进行鉴定.利用免疫磁珠分离法从正常足月出生儿脐带血中分离CD34+细胞.应用3种不同培养体系进行脐血CD34+细胞的体外扩增:单独应用脐带源间充质干细胞作基质层、细胞因子培养体系和间充质干细胞联合细胞因子培养体系.主要观察指标:应用细胞计数法、集落培养计数法和流式细胞学检测法对扩增后细胞数量、集落形成能力和免疫表型进行分析比较.RT-PCR检测间充质干细胞中细胞因子的表达情况.结果:培养第14天后,间充质干细胞组的CD34+细胞比例明显高于细胞因子联合间充质干细胞组;CD34+细胞总数为培养前的(4.19±1.37)倍,明显高于细胞因子组.培养第7天和第14天,间充质干细胞组的CD34+CD38-细胞亚群比例均高于另两组.RT-PCR结果显示,脐带源间充质干细胞体外可表达干细胞因子和血小板生成素早期干细胞效应因子.结论:单独应用脐带源间危质干细胞可有效地对脐血CD34+细胞进行体外扩增,更有利于保持较早期干、祖细胞的扩增.     

人类ermap基因在脐血单个核细胞向红细胞系分化发育过程中表达的研究

为探讨人类红细胞膜相关蛋白（erythroid membrane associated protein，ERMAP）基因在红细胞分化发育过程中的作用，本研究以SCF、IL-3和EPO体外诱导脐血单个核细胞（mononuclear cells，MNCs）向红系细胞方向分化，在此过程中用光学显微镜观察细胞形态，用联苯胺染色计数细胞阳性率，流式细胞术检测CD36^＋／CD235a^-、CD36^＋／CD235a^＋、CD36^-／CD235a^＋细胞的比例，同时以荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR，FQ—PCR）检测人类ermap基因表达量的变化。结果表明，SCF、IL-3和EPO可诱导脐血MNCs向红系方向分化，在此过程中人类ermap基因的表达量不断增加。结论：人类ermap基因与红细胞分化发育密切相关     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血单个核细胞表面抗原表达的影响

背景:课题组已建立胎儿骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系,该培养体系能否有效扩增各个发育阶段的造血细胞有待验证。目的:观察骨髓基质细胞联合细胞因子培养体系对脐血单个核细胞表面抗原CD133、CD34表达的影响。方法:将从脐血标本中分离出来的单个核细胞接种于无血清培养体系,实验分为3组:①F组:干细胞因子+Flt3配体+促血小板生成素+单个核细胞。②S组:基质细胞+单个核细胞。③SF组:基质细胞+干细胞因子+Flt3配体+促血小板生成素+单个核细胞。在第0,6,10,14天检测有核细胞总数、CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞数以及集落形成单位数。结果与结论:SF组有核细胞总数在各个检测时间点均比其他两组高;除了第14天外,第6、10天两个时间点SF组中CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞及集落形成单位数均高于其他组;含骨髓基质细胞的S组和SF组中CD133+细胞/有核细胞、CD34+细胞/有核细胞、CD133+CD34+细胞/有核细胞的比例保持在较高的水平。结果说明骨髓基质细胞联合细胞因子能有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133+、CD34+、CD133+CD34+细胞,基质细胞对维持造血干细胞的原始性具有重要的作用。     

干细胞因子对内皮细胞增殖、迁移、管状形成能力的影响及对CD133+细胞的趋化效应

目的 探讨干细胞因子(SCF)对脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移、管状形成能力的影响,以及对CD133+细胞的趋化效应.方法 应用MTT及CCK-8增殖分析法检测HUVEC在不同细胞因子[空白试剂、SCF、血管内皮生长因子(VEGF)、抗人SCF、人IgG]条件下增殖能力的差异性;采用细胞划痕法与Matrigel体外三维成型法分别检测内皮细胞的增殖、迁移和管状形成能力;并应用Transwell技术检测不同细胞因子诱导的CD133+细胞体外趋化效应.结果 MTT及CCK-8增殖分析结果显示SCF无HUVEC增殖刺激活性;SCF可显著提升HUVEC迁移能力;SCF呈剂量依赖性增强HUVEC 管状形成能力,在适宜浓度SCF(100 ng/ml)作用下,HUVEC完整小管形成数量[(30.0 ±3.4)/105HUVEC]显著高于空白试剂组[(5.0±2.6)/105HUVEC,P<0.01];SCF可高效诱导CDl33+细胞体外趋化,SCF组[(118.0±6.5)/104CD133+细胞]Transwell小室跨膜迁移细胞数显著高于空白试剂组[(47.0±4.7)/104CDl33+细胞,P<0.01].结论 SCF可显著增强HUVEC的迁移及管状形成能力,并有效诱导CD133+细胞体外趋化,提示SCF/c-kit信号转导在内皮细胞及其祖细胞的血管新生与血管发生过程中可能发挥重要作用.

Abstract：

Objective To explore the effects of stem cell factor (SCF) on proliferation, transmigration, capillary tube formation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and on the chemotaxis of CD133+ cells. Methods In the presence of blank control, SCF, vascular endothelial growth factor ( VEGF) , anti-human SCF (anti-SCF) or human IgG, the difference in proliferation capacity of HUVEC was analyzed by MTT and CCK-8 methods, and wound scratch assay and three-diamensional in vitro Matrigel assay were used for transmigration and capillary tube formation of HUVEC, respectively. In addition, the chemotaxis of CD133 + cells sorted from human umbilical cord blood by flow cytometry was investigated by Transwell migration assay. Results SCF didn't improve the proliferative capacity of HUVEC, but significantly enhanced the transmigration capacity, and increased capillary tube formation in a dose-dependent manner.The number of intact tubules [(30.0 ±3.4)/105 HUVEC] formed by HUVECs in the presence of the optimal concentration of SCF (100 ng/ml) was remarkably higher than that in blank control group [(5.0 ±2.6)/105HUVEC,P <0.01]. SCF also significantly induced a chemotactic response of CD 133+ cells, the transmembrane migration cell number into Transwell lower chamber was significantly higher in SCF group [(118.0 ±6.5)/104 CD133+ cells] than in blank control group [(47. 0 ±4. 7)/104 CD133 + cells,P <0.01]. Conclusions SCF significantly promotes the transmigration and capillary tube formation of HUVEC, and induces a chemotactic response of CD133 + cells. SCF/c-kit signaling possibly plays a critical role in regulating angiogenesis of vascular endothelial cells and vasculogenesis of endothelial progenitor cells.     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133+细胞体外扩增作用的研究

为了探讨胚胎骨髓基质细胞（FBMSC）联合细胞因子对脐血单个核细胞（MNC）中CD133＋细胞的体外扩增作用,将新鲜脐血（CB）中分离出来的MNC接种于无血清培养体系中培养14天。实验分为4组：C组为空白对照组,不含基质细胞和细胞因子;S组为单用基质细胞组;F组为单用细胞因子组;SF组为联合使用基质细胞和细胞因子组。在第0,6,10及14天检测有核细胞总数、CD133＋细胞数及集落形成单位（CFU）数。结果表明：各时间点SF组有核细胞总数的扩增倍数均高于其它组;除了第14天外,SF组在第6、10天时CD133＋细胞数、CFU数的扩增倍数均高于其它组。结论：胚胎骨髓基质细胞对延缓造血细胞的分化具有重要的作用,基质细胞联合细胞因子可以有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133＋细胞,这是一种比较接近于临床移植要求的造血细胞体外扩增方法。     

Clinical isolation and functional characterization of cord blood CD133+ hematopoietic progenitor cells

BACKGROUND: Human cord blood is a relevant source of CD133+ HPCs. Clinical-scale isolation of human umbilical cord blood (UCB) CD133+ HPCs using immunomagnetic microbeads and the CliniMACS clinical cell isolator is reported. CD133+ HPCs isolated after large-scale processing were functionally characterized. STUDY DESIGN AND METHODS: Closed disposable sets were used to process nine different samples of RBC-reduced UCB nucleated cells. In-vitro hematopoietic assays and human xenografts in NOD/SCID mice were performed to assess the functional properties of isolated CD133+ cells. Different mixtures of human cytokines were tested for the ability to expand nascent CD133+ HPCs. Furthermore, freshly isolated CD133+ cells were conditioned in culture medium specifically tested to support in-vitro myogenesis or osteogenesis. RESULTS: Isolation procedures yielded the recovery of an average of 2.53 x 10(6) CD133+ HPCs with a mean recovery of 96 percent (referred to as RBC-reduced samples) and a final sample purity of 82 percent. Purified CD133+ cells had high cloning efficiency, had relevant long-term activity, and were capable of repopulating irradiated NOD/SCID mice. In 10-day stroma-free cultures, a 2-fold and 8.3-fold expansion of colony-forming cells (CFCs) and extended long-term culture-initiating cells, respectively, was obtained. Freshly isolated CD133+ cells differentiated into large nucleated cells expressing either myosin D or osteopontin (as revealed by RT-PCR and immuno-cytochemistry), with a protein/mRNA expression comparable to or even higher than that observed in UCB CD133- nucleated cells in identical culture conditions. CONCLUSION: Collectively, clinical-scale isolation of UCB CD133+ cells provides a relevant amount of primitive HPCs with high hematopoietic activity and in-vitro mesenchymal potential.     

脐血来源AC133+细胞在不同诱导条件下神经分化标志物的表达

背景：近年来，在啮齿类动物中发现，造血干细胞具有向神经分化的塑型性，而在人类，这种造血的塑型性仍然具有争议。目的：榆测人脐血来源的AC133^＋造血干细胞是否具有向神经分化的潜能。设计、时间及地点：本实验为成组对照设计实验，于2005—08／2007—12在天津血液学研究所和清华大学玉泉医院神经中心实验室完成。材料：人脐带取自健康足月新生儿。胎脑滋养层细胞来源于22周流产胎儿脑组织。方法：应用免疫磁珠分选人脐血AC133^＋细胞，流式细胞仪检测其纯度为99％以上。同时以机械分离及酶消化法制备胎脑滋养层细胞。选用4种培养条件对脐血来源AC133^＋造血干细胞进行诱导分化：①生长培养液DMEM／F12加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子。②DMEM／F12加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子并联合使用脑源性生长因子，其间用全反式维甲酸处理3d。③非细胞接触的共培养体系，先将制备的胎脑滋养层细胞生长在培养板内插件的半透膜上，与培养板内的脐血来源的AC133^＋细胞进行共培养。④细胞直接接触共培养，将预先用BrdU标记的脐血来源的AC133^＋细胞直接种在胎脑滋养层细胞上进行共培养。主要观察指标：1，2，4周收集诱导分化的脐血细胞，以RT-PCT检测是否有巢蛋白、骨形态生成蛋白2及神经细胞黏附分子的表达，免疫细胞化学方法检测细胞分型特异性抗原。结果：部分脐血来源的AC133^＋细胞，在体外存在生长必需的因子上皮生长因子和碱性成纤维生长因子时，能表达一些与神经细胞分化有关的基因，如巢蛋白、骨形态生成蛋白，条件不同时，这些基因出现下调和关闭。在DMEM／F12加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子联合使用脑源性生长因子诱导培养液中，上述基因表达在2周时可检测到，同时可榆测到神经发育过程中出现的另一分子神经细胞黏附分子，这一分子在造血过程中并不出现，在使用内插件的胎脑滋养层细胞共培养的脐血细胞中也检测到相同结果。在优化的非细胞接触条件中主要表达胶质酸性蛋白，在细胞直接接触的共培养体系中出现神经元分化的标志物Ⅲ β-tubulin蛋白的表达。这种基因表达变化提示，在特定的培养环境下，脐血来源的AC133^＋细胞内可能出现了基因重排，使造血潜能的干细胞表达神经细胞发育分子。结论：脐血来源的AC133^＋细胞包含部分具有向神经分化潜能的多能干细胞，在适合条件下，表达神经分化相关抗原。     

脐血CD133^＋细胞体外扩增巨核系祖细胞的研究

本研究探讨脐血CD133^＋（UCB—CD133^＋）细胞体外扩增巨核系祖细胞的能力和最佳收获时间。采用免疫磁珠激活细胞分选系统（MACS）分选UCB—CD133^＋细胞，将纯化的UCB—CD133^＋细胞接种于含TPO、IL-3和SCF的无血清液体培养体系中体外扩增巨核系祖细胞，在培养第7、10和14天进行细胞计数，流式细胞仪检测扩增过程中CD133、CD34、CD41抗原表达的动态变化，并采用半固体法对不同扩增阶段的细胞进行巨核祖细胞集落形成单位（CFU—MK）培养。结果表明：培养至第7天时，UCB—CD133^＋细胞扩增效果最佳，扩增了8、2-1-2．2倍；培养至第14天，细胞总数扩增了116倍；培养至10天时，平均1个CD133^＋细胞所产生的CD133^＋CD41^＋和CD34^＋CD41^＋细胞数最多，分剐为2．5±0．9和2．6±0.5个，所产生的CD41^＋细胞为20．3±5、9个；扩增前后的UCB—CD133^＋细胞均能形成CFU—MK，扩增第10天的UCB—CD133^＋细胞所形成的CFU—MK总数最多，CFU—MK扩增倍数为59．5±11．8倍。巨核细胞免疫组织化学染色显示，扩增后的巨核系细胞多呈幼稚状态，未见血小板形成。结论：UCB—CD133^＋细胞具有较强的体外扩增巨核系祖细胞的能力，培养第10天扩增效能最佳。     

人脐静脉内皮细胞抑制单核细胞源树突状细胞的产生

本研究旨在探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对树突状细胞(DC)发育的影响.首先,利用酶消化法从人脐带分离获得HUVEC,从细胞形态、表型和功能进行鉴定;进一步将获得的HUVEC结合细胞因子配伍与CD14+单核细胞共培养,检测HUVEC对CD14+细胞向DC分化的影响;流式细胞术检测分化细胞的表型,混合淋巴细胞反应检测分化细胞的免疫学功能;采用中和抗体实验和Western blot检测对细胞增殖和分化起重要调控作用的IL-6和VEGF以及ERK和p38MAPK通路的改变.结果表明,从脐静脉分离获得的细胞呈长梭形形态,细胞表型为vWF+ CD31+ CD73+CD45-HLA-DR-CD86-CD34low,Dil-Ac-LDL吸收实验为阳性,且细胞可诱导形成血管样结构,提示分离获得了HUVEC;进一步将HUVEC与CD14+单核细胞共培养,流式细胞仪检测结果表明HUVEC可抑制CD14+单核细胞向DC的分化,诱导获得的细胞CD1a表达显著降低,混合淋巴细胞检测结果显示,与HUVEC共培养获得的DC刺激T细胞增殖作用显著降低,且具有剂量依赖性;中和抗体实验分析其可能的作用机制表明,IL-6和VEGF在CD14+单核细胞向DC分化过程中具有重要调控作用,Western blot检测结果说明其主要通过ERK和p38通路完成调控作用.结论:人内皮细胞参与DC的发育,且起到抑制作用.

Abstract：

This study was aimed to investigate the effect of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)on dendritic cell(DC)development.First,HUVEC were isolated from human umbilical cord by collagenase digestion,and then the morphology,immunophenotypes and functions were identified.Furthermore,the HUVEC were cocultured with CD14+ monocytes under the cytokine condition for detecting the influence of HUVEC on differentiation of CD14+ cells to DC.The phenotype of dendritic cells derived from CD14+ cells was analyzed by flow cytometry,the immunoregulatory function of DC was tested by mixed lymphocyte reaction(MLR).The change of IL-6 and VEGF as well as EPK and p38 signal pathway were analyzed by neutral antibody experiment and Western blot.The results showed that HUVEC isolated from human umbilical cord were characterized by spindle-shaped morphology,homogenous immunophenotypes (vWF+ CD31+ CD73+ CD45-HLA-DR-CD86-CD34(low),Dil-Ac-LDL incorporation ability and forming capillary-like structures.Following stimulation with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)plus interleukin-4 (IL-4),HUVEC cocultures could inhibit the initial differentiation of CD14+ monocyte to DC.Interestingly,IL-6 and VEGF enhanced the suppression effect of HUVEC on generation of DC via activation of the ERK or p38 mitogen activated protein kinase pathway.It is concluded that HUVEC are involved in DC development and can suppress the differentiation of monocyte to DC.     

基于磁性纳米粒子-抗体复合物分离CD34+细胞的新技术

本研究合成磁性纳米粒子-抗体复合物（magnetic nanoparticles-antibody,MNPs-Ab）,建立用此复合物从脐带血中分离CD34^＋细胞的方法并评价其效果。利用磁性纳米粒子-抗体复合物的超顺磁性和对CD34^＋细胞的识别及结合功能,在外加磁场的作用下,分离脐血中的CD34^＋细胞;用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy,SEM）观察分离后CD34^＋细胞的形态变化;用流式细胞仪（flow cytometer,FCM）分析分离效率;用液体培养和集落培养鉴定CD34^＋细胞增殖能力和多向分化能力。结果显示：利用磁性纳米粒子-抗体复合物可以快速、高效地将CD34^＋细胞从脐血中分选出来,而且分离后的CD34^＋细胞仍然保持正常形态、高度的增殖能力和多向分化能力。结论：成功地研制了磁性纳米粒子-抗体复合物分离CD34^＋细胞技术,该技术能高效、快速地分离CD34^＋细胞。     

脐血来源树突状细胞的体外诱导及扩增

本研究的目的是分析脐血的细胞组成 ,研究加入细胞因子培养前后脐血树突状细胞的变化 ,探索体外诱导、扩增树突状细胞的方法并进行表型鉴定。选择正常成人外周血 9份 ,脐血 12份 ,分离单个核细胞。在脐血单个核细胞中加入细胞因子GM CSF、IL 3、SCF和EPO ,培养 4周。应用流式细胞仪和CD4、CD8、CD19、CD34、CD38、CD1a、CD11c及CDw12 3单克隆抗体测定正常成人外周血、培养前后 1,2 ,3,4周脐血细胞表面抗原及树突状细胞情况。结果表明 :正常成人外周血CD34 细胞 0 .0 2× 10 5 ml,CD1a 细胞 0 .0 1× 10 5 ml,CD11c 细胞 4 .32×10 5 ml,CD83 细胞 1.31× 10 5 ml,CDw12 3 细胞 1.4 1× 10 5 ml。新鲜脐血中CD34 细胞 0 .2 2× 10 5 ml,CD1a 细胞 0 .2 7× 10 5 ml,CD11c 细胞 5 .87× 10 5 ml,CD83 细胞 1.94× 10 5 ml,CDw12 3 细胞 2 .73× 10 5 ml。加入细胞因子GM CSF ,IL 3,SCF ,EPO后培养 1- 4周的脐血单个核细胞分化为CD1a ,CD11c ,CD83 ,CDw12 3 树突状细胞 ,在培养的 2 - 4周 ,脐血树突状细胞数量明显增多 ,此后逐渐减少。通过培养 ,树突状细胞数量增加 ,CD1a 细胞达 11.0 2× 10 5 ml,CD11c 细胞 2 8.2 4× 10 5 ml,CD83 细胞 10 .5 7× 10 5 ml,CDw12 3 细胞 18.7× 10 5