HIV-1感染者及其密切接触者HIV-1抗性基因的研究

目的:研究CCR2-64I、SDF1-3'A2种HIV-1抗性基因在山东省HIV-1感染者及其密切接触者中的分布,以及它们对艾滋病病程进展和人群易感性的影响。方法:利用体外扩增PCR和限制性片段长度多态性分析RFLP检测目标人群中的HIV-1抗性基因,用统计学方法分析基因分布频率与病程进展和易感性的关系。结果:CCR2-64I、SDF1-3'A的突变频率分别为23.64%、23.94%,含SDF1-3'A1的患者平均潜伏期为(8.33±1.16)年,含CCR2-64I患者平均潜伏期为(8.94±1.17)年,野生纯合子患者为(7.42±1.33)年。结论:本研究首次阐明了CCR2-64I、SDF1-3'A在山东省HIV-1感染者及其密切接触者中分布的特点,并发现2种抗性基因的存在均可延缓感染者的病程。     

新疆维吾尔族HIV-1感染者gag基因序列分型研究

目的 通过扩增新疆地区HIV-1感染者gag基因片段,确定HIV-1感染者流行株的基因亚型.方法 抽提88例新疆乌鲁木齐市和伊宁市HIV-1感染者的血浆标本的RNA,用巢式PCR扩增gag基因片段,将所得到的序列与国际标准株进行比较,确定被检标本的亚型.结果 在88例HIV感染者的血浆标本中,共成功扩增57例gag基因片段,扩增率为64.8％.经BLAST初步判断和构建进化树并与国际标准株比对确认,57例感染者感染的HIV毒株序列中,有56个为CRF07_BC亚型,1例为C亚型.57例毒株之间的平均基因距离为0.043±0.003,与3例CRF07_BC亚型国际参考株之间的平均基因距离在0.034±0.004～0.039±0.005之间.结论 新疆地区HIV-1感染者以CRF07_BC亚型为主要流行株.57例序列相互之间以及与3株不同来源的国际参考毒株之间表现出高度的同源性.     

Alu-反向PCR检测HIV-1整合位点方法的建立

目的建立Alu-反向PCR检测整合型HIV-1DNA的实验方法。方法收集18例HIV-1感染者及12例健康者的抗凝血标本,根据整合型HIV-1DNA的特点设计引物,第一轮PCR5’端引物来自于人类保守的Alu序列,3’端引物来自于HIV-1gag序列,扩增片段包含了整合位点上游的人类基因组DNA序列和整合的HIV-1DNA序列。经PstⅠ酶切后进行自身片段环化,以此为模板设计针对HIV-1LTR和gag保守区域引物,进行巢式PCR。结果 16例HIV-1感染者成功扩增出目的片段,12例健康者均为阴性。结论本实验建立的检测整合型HIV-1的方法为进一步研究HIV病毒储藏库机制提供了参考。     

伊宁市19例HIV-1感染者gag基因序列分型研究

目的：通过扩增伊宁市维吾尔族HIV-1感染者gag基因片段,确定该民族HIV-1感染者流行株的基因亚型。方法：抽提20例新疆伊宁市HIV-1感染者的血浆标本的RNA,用巢式PCR扩增gag基因片段。将所得到的序列与国际标准株进行比较,确定被检标本的亚型。结果：在20例HIV感染者的血浆标本中,共成功扩增19例gag基因片段,扩增率为95％。经BLAST初步判断和构建进化树并与国际标准株比对确认,19例感染者感染的HIV毒株序列中,发现18例为CRF07_BC亚型,1例为C亚型。19例毒株之间的平均基因距离为0．043±0．003,与3例CKF07_BC亚型国际参考株之间的平均基因距离在0．034±0．004-0．039±0．005之间。结论：新疆伊宁市HIV-1感染者以CRF07_BC亚型为主要流行株。19例序列相互之间以及与3株不同来源的国际参考毒株之间表现出高度的同源性。     

基于SOCS1-TLR2信号通路探讨HIV/结核分枝杆菌合并感染的发病机制

目的：探讨巨噬细胞的细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)-Toll样受体2(TLR2)信号通路在人免疫缺陷病毒（HIV）促进结核分枝杆菌（Mtb）感染中的作用机制。方法：采集HIV-1单感染者、Mtb单感染者、HIV-1/Mtb合并感染者和健康对照者的外周静脉血，分离外周血单个核细胞（PBMCs），流式细胞术检测PBMCs中单核巨噬细胞的SOCS1、TLR2及下游Mtb感染相关因子表达。基于巨噬细胞—HIV—Mtb感染模型，探讨SOCS1-TLR2在HIV促进Mtb感染中的作用。结果：与健康对照组相比，HIV-1单感染组、Mtb单感染组和HIV-1/Mtb合并感染组中白细胞介素（IL）-6、IL-10蛋白表达水平升高（P<0.05）;Mtb单感染组IL-1β、IL-12和干扰素（IFN）-γ蛋白表达水平升高（P<0.05）。体外细胞实验中，与对照组相比，HIV-1单感染组、Mtb单感染组和HIV-1/Mtb合并感染组中SOCS1 mRNA表达水平升高（P<0.05）；与对照组相比，HIV-1单感染组和HIV-1/Mtb合并感染组TLR2 mRNA表达水平下降（P&...     

梅毒对HIV-1感染者病毒载量和CD4+T细胞计数的影响

目的:评估梅毒对HIV-1感染者血浆HIV-1病毒载量,CD4 T细胞计数的影响.方法:于1年前对HIV-1感染者进行梅毒ELISA和RPR检测,对RPR检测阳性者根据其CD4 T细胞计数和病毒载量进行配对,与1年后重新检测CD4 T细胞计数与病毒载量比较,用配对资料的t检验分析梅毒对HIV感染者CD4 T细胞与病毒载量的影响.结果:在271例HIV-1感染者中,共11例梅毒阳性者,占4.1%.本研究中包括HIV-1感染者20例,其中10例梅毒与HIV-1共感染者.在梅毒与HIV共感染者病例中,CD4 T细胞计数明显降低(99个细胞/ml),但病毒载量的变化没有显著差异.结论:梅毒显著地降低HIV-1感染者的CD4 T细胞数量,但病毒载量没有明显的变化.为了延缓HIV-1感染者进入AIDS阶段的时间,应加强对梅毒的治疗和采取相应的预防措施.     

HIV-1 LTR区结构和功能的研究进展

长末端重复序列(LTR)在HIV-1表达调控中起到了重要作用.在HIV-1基因组LTR区存在着和各种转录因子的结合位点,各种调节蛋白通过和DNA相互作用以及蛋白间的相互作用形成一个复杂的调节网络,调节病毒结构蛋白和非结构蛋白的表达.针对HIV-1 LTR区以及宿主细胞中HIV-1表达调节蛋白的研究,为研制抗AIDS药物提供了新的方式.     

同一HBV感染者外周血单个核细胞与肝组织中HBV DNA

用聚合酶链反应(PCR)及Southern印迹杂交检测了16例慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者外周血单个核细胞(PBMCs)及肝组织中HBV DNA.有13例同时在PBMCs及肝组织中检出HBV DNA,1例仅在PBMCs中检出,1例只在肝组织中检出。结果表明,在慢性HBV感染过程中PBMCs可同时被感染。     

DC-SIGN和DC-SIGNR基因多态性分析与HIV-1易感性关系研究

目的 通过分析DC-SIGN和DC-SIGNR的基因多态性分布及基因频率在健康人群、HIV-1感染者和HIV-1长期暴露不感染人群(ES)的差别,探讨这两个基因与HIV-1长期暴露不感染的关系.方法 纳入三组研究对象,包括健康对照组(160例),HIV-1感染者组(267例),ES组(37例).扩增DC-SIGN和DC-SINGR基因的颈区重复序列进行分析.结果 三组人群DC-SIGN基因型以7/7为主,等位基因呈低度多态性.DC-SIGNR基因型以7/7为主,等位基因呈高度多态性,出现了较多的非7/7基因型,其中等位基因6在三组间以及在HIV-1感染者和ES之间分布的差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 DC-SIGN基因多态性变异很低,对人群HIV-1易感性的研究意义不大;DC-SIGNR基因呈高度多态性,其低频率等位基因6可能是人群对HIV-1不易感的保护因素.     

柳州市吸毒者HIV-1病毒流行株34例检测分析

目的 了解流行于柳州市吸毒者艾滋病病毒HIV-1毒株的亚型及各种亚型的分布特点.方法 对34例HIV感染者进行详细的流行病学调查,并采集外周静脉防凝血,提取前病毒DNA进行体外扩增,获得包膜蛋白(env)、核心蛋白(gag)、tat区基因的核酸片段,并对各基因区核苷酸进行测定和分析.结果 发现在所有目标人群中共存在B、C 2种亚型以及CRF07-BC(44.12%)和CRF01AE(55.88%)2种重组毒株.结论 柳州市HIV-1亚型以B、C为主,重组毒株以CRF07-BC和CRF01-AE几乎各占一半,柳州市HIV-1亚型比较单一,控制柳州市HIV-1亚型的多样性,做好防艾任重而道远.     

HIV感染和抗反转录病毒治疗对PBMC线粒体DNA含量影响

目的探讨艾滋病病毒（HIV）和联合抗反转录病毒治疗（cART）对外周血单个核细胞（PBMC）中线粒体DNA含量的影响,及PBMC中线粒体DNA含量和脂肪代谢异常（LD）的关系。方法采用实时定量PCR检测未治疗、已经治疗的HIV感染者和正常对照组外周血单核细胞（PBMC）中线粒体DNA相对含量,比较不同人群PBMC中线粒体DNA有无差异,比较发生LD和未发生该症状患者线粒体DNA含量有无差异。结果未接受抗病毒治疗的HIV感染者和已治疗的HIV患者PBMC中线粒体DNA含量为非感染者的0.61倍和0.8倍,但无显著性差异（P=0.122）。发生LD患者PBMC中线粒体DNA相对含量（2-△△Ct）比无LD患者显著降低（0.57vs.1.12,P=0.045）。结论发生LD的患者血中PBMC中线粒体DNA含量显著下降,可能作为潜在临床辅助诊断指标,但需进一步研究。     

Alu-LTR PCR检测整合型HIV-1实验方法的优化

目的对Alu-LTRPCR检测整合型HIV-1的实验方法进行优化。方法收集20例HIV-1感染患者及10例健康对照者的抗凝血标本,纯化CD4+T细胞并提取DNA,根据整合型HIV-1DNA的特点设计引物,首轮PCR5′端引物来自于人类保守的Alu序列,3′端引物来自于HIV-1LTRU5区序列,扩增片段包含了整合位点上游的人类基因组DNA序列和整合的HIV-1LTR的序列。第二轮引物针对HIV-1LTRU3区的序列。在首轮PCR基础上,PCR产物稀释后进行第二轮PCR。结果经过优化的Alu-LTRPCR,20例HIV病人全部检测到整合的HIV-1。结论经优化后,Alu-LTRPCR检测整合型HIV-1的实验方法的灵敏度明显提高。     

乙型肝炎病毒S区和C区基因长片段扩增新方法的探讨

目的 :为HBV基因研究提供一个灵敏度和扩增效率均较佳的长片段PCR新方法 .方法 :应用自行设计的引物扩增血清中HBVS区和C区的 2 .5kb基因 ,并与HBV全长扩增方法进行比较 .结果 :HBV 2 .5kbPCR方法在HBsAg阳性患者血清中的阳性检出率明显高于全长PCR方法 (P <0 .0 5 ) ,相同反应条件下 2 .5kbPCR产物的平均A值和灰度总值也高于 3.2kb的全长基因组 (P <0 .0 5 ) .结论 :HBV2 .5kbPCR方法的灵敏度和扩增效率高于全长PCR方法 ,可作为HBV相关疾病研究中的一种新的技术手段     

HBV感染者外周血单个核细胞中HBV DNA的检测

目的；研究乙型肝炎毒（ＨＢＶ）感染者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）中ＨＢＶ ＤＮＡ的存在及其与血清ＨＢＶ ＤＮＡ的关系。方法：用ＰＣＲ法及斑点杂交法对５０例ＨＢｓＡｇ（＋）的感染者ＰＢＭＣｓ ＨＢＶ ＤＮＡ进行检测。同时用ＰＣＲ法检测感染者血清ＨＢＶ ＤＮＡ。结果：ＰＣＲ法和斑点杂交法分别从３５份和３２份ＰＣＭＣｓ检出率均为６０．０％左右。ＰＣＲ法检测血清ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率为３６．０％。结论：Ｈ     

人类免疫缺陷病毒-1感染者外周血单个核细胞体外培养的免疫学及病毒学特点

目的观察人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者外周血单个核细胞(PBMC)体外培养过程中免疫学及病毒学的动态变化特点,并评价培养的细胞体系抗病毒活性。方法采集14例HIV感染者和6名健康人的PBMC,体外经多种细胞因子诱导培养,每3天观察细胞增殖情况,同时检测细胞表型、上清中细胞因子浓度和病毒载量。结果培养的健康人PBMC在(35±5)d最大增殖(61±8)倍;7例培养成功的HIV感染者PBMC在(21±6)d最大增殖(17±13)倍,另7例HIV感染者PBMC培养失败;同时发现HIV感染者PBMC体外培养最大增殖时间与其培养前外周血基础CD4/CD8比值呈明显正相关(P<0.05)。表型分析发现,培养的PBMC为优先CD8细胞增殖的异质T细胞群,主要由CD4、CD8及CD3CD56细胞组成;部分HIV感染者PBMC培养期间分泌白细胞介素(IL)1α、IL12、肿瘤坏死因子(TNF)α和IL10等细胞因子能力较高;而11/12例HIV感染者PBMC体外培养初期可扩增出大量病毒,但随着培养时间的延长,病毒载量逐渐降低甚至低于检测限。结论体外大量扩增基础CD4/CD8比值较高的HIV感染者外周血PBMC是可行的,扩增的细胞具备较强的Th1细胞免疫反应能力,为进一步开展艾滋病的免疫细胞治疗提供必要的实验数据。     

人caspase-1真核表达载体的构建及表达

目的构建人caspase-1真核表达载体,观察其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法分离人外周血淋巴细胞,LPS刺激提取细胞总RNA,RT-PCR方法分别扩增caspase-1两片段S1、S2,利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得caspase-1全长序列,将其克隆入pIRES2-EGFP载体,进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染HepG2肝癌细胞,倒置相差荧光显微镜下观察其表达情况,RT-PCR分析caspase-1的表达水平。结果份外周淋巴细胞中经RT-PCR分别扩增出365bp和883bp片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一1234bp的条带,与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ限制性酶谱分析酶解出1234bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GenBank中人caspase-1序列完全一致。将该载体转染至HepG2细胞中,经RT-PCR证实,与转染pIRES2-EGFP空载体的对照组细胞相比,caspase-1水平明显升高。结论本研究成功构建人caspase-1表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1,该载体能够在人肝癌细胞中高效表达外源基因。     

构建单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因真核表达载体

从单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV－Ⅱ）Sav株感染的Hep-2细胞培养液和细胞裂解液中提取HSV－Ⅱ基因组DNSA，以此为模板，用PCR方法获取胸苷激酶（TK）基因，将获取的DNA片段克隆入真核表达载体pcDNA3中，筛选阳性克隆测序，结果表明：本研究获取的HSV－Ⅱ－TK基因全部编码区为1128bp，编码376个氨基酸，结果表明：本研究扩增出HSV－ⅡTK基因的全部编码区序列，并成功构建真核表达载体pcDNA3／TK.     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。