野生型p53基因对胰腺癌细胞的抑制作用

目的：观察人类野生型p53（wtp53）基因对人胰腺癌细胞的抑制作用。方法：用逆转录病毒为载体将外源性wtp53基因导入人胰腺癌细胞系PC－2，通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及对肿瘤的抑制作用，结果：p53在转染细胞PC－2／p53中表达水平提高，外源性wtp53基因的导入和表达能使PC－2细胞的生长速率减低，软琼脂集落形成能力下降，G0＋G1期细胞比例增加，凋亡指数升高，裸鼠体内成瘤能力明显下降，结论：逆转录病毒载体介导的外源性野生型P53能抑制人胰腺癌细胞生长。     

野生型p53基因重组质粒的构建及对人卵巢癌细胞的抑制作用

目的:研究p53基因转染对卵巢癌细胞系SKOV-3生物学行为的影响.方法:用分子克隆技术构建人野生型p53基因与真核细胞表达载体PCNDA3的重组体(PCNDA-p53),并用脂质体介导的转染技术,将其导入不表达p53的人卵巢癌SKOV-3细胞中,经筛选、鉴定后,观察细胞生长速度、集落形成能力和增殖周期的变化.结果:成功地构建了人野生型p53基因与真核细胞表达载体的重组体,转染后获得稳定表达p53的转染克隆.外源性p53基因的表达明显抑制了卵巢癌细胞的生长速度及集落形成能力,使细胞阻滞于G1期.结论:外源性野生型p53基因能抑制卵巢癌细胞的增殖.     

野生型p53对胃癌细胞系的生长抑制作用

目的：观察野生型p53对胃癌细胞系的生长抑制作用。方法：以逆转录病毒为载体将野生型p53基因导入胃癌细胞系MKN28和BGC823，检测p53对肿瘤细胞的影响。结果：p53在转染细胞中表达水平提高。外源性p53的导入使肿瘤细胞增殖细胞核抗原（PCNA）水平明显降低；G0／G1期细胞数增加，S期降低。转染p53基因的MKN28细胞探鼠体内成瘤能力明显下降。结论：野生型p53基因参与调节DNA复制及细胞周期，抑制癌细胞过度增殖。     

抑癌基因联合转染对膀胱癌细胞的生长抑制作用研究

目的；探讨抑癌基因p53和Rb对膀胱癌细胞的生长抑制作用。方法：利用逆转录病毒和电穿孔法将p53,Rb单独或联合导入膀胱癌细胞株T24中，Northern杂交等证实外源目的基因的表达后，观测并比较不同转染后细胞的生长、增殖水平和成瘤性等。结果：获得p53、Rb单独和联合转染的T24细胞，Northern杂交等证实T24细胞中p53失活而Rb正常，转入的外源野生型p53基因和Rb基因均被表达。与未转染的对照组T24细胞相比，转入p53的细胞其生长速率明显降低，细胞增殖受抑制，软琼脂克隆形成能力丧失；而只转染Rb的细胞除软琼脂克隆形成能力有所降低外，细胞生长和增殖未受明显抑制。结论：外源野生型p53能抑制T24生长并降低基成瘤性，增加Rb的表达对细胞生长无明显抑制作用。p53对T24细胞的生长抑制作用与外源Rb基因导入与否无明显关系，Rb表达水平正常的膀胱癌细胞其异常增殖可能与Rb蛋白磷酸化状态的关系更为密切。     

逆转录病毒介导的p53基因对食管癌细胞株的生长抑制作用

目的 :观察人类野生型 p5 3(wtp5 3)基因对人食管癌细胞系的抑制作用。　 方法 :用逆转录病毒为载体 ,将外源性wtp5 3基因导入人食管癌细胞系ECA10 9,通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及其对肿瘤的抑制作用。　结果 :p5 3在转染细胞ECA10 9/p5 3中表达水平提高。外源性wtp5 3基因的导入和表达能使ECA10 9细胞的生长速度减低 ,软琼脂集落形成能力下降 ,G0 G1期细胞比例增加、S期细胞比例降低 ,调亡指数升高 ,裸鼠体内成瘤能力明显下降。　结论 :逆转录病毒载体介导的外源性wtp5 3基因能够抑制人食管癌细胞生长     

野生型p53基因转染对宫颈癌HeLa细胞生长及药物敏感性的影响

目的：探讨转染外源野生型p53基因对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用。并了解p53基因与HeLa细胞对顺铂敏感性之间的关系。方法：利用脂质体介导，将含人野生型p53cDNA的cCB6.p53质粒导入人宫颈癌HeLa细胞株中，筛选阳性克隆，用免疫组化ABC法检测p53基因的表达情况，加入顺铂72小时后，用四唑盐比色试验检测存活的HeLa细胞数。结果：在G418选择培养基中培养两周后，成功地生长出阳性细胞克隆，免疫组化法证实外源性p53基因在瘤细胞中稳定存在并传给子代，p53基因转染对HeLa细胞的生长有明显的抑制作用。p53表达阳性的HeLa细胞对顺铂的敏感性明显增加，结论：野生型p53基因转染能使HeLa细胞出现生长抑制和化疗敏感性增强。     

野生型p53基因抑制胆囊癌细胞裸鼠体内生长的实验研究

目的：研究转染野生型p53（wtp53）基因对胆囊癌细胞裸鼠体内生长的影响。方法：在脂质体介导下将含有wtp53的真核表达质粒pCMV—p53，导入GBC—SD细胞中。用G418筛选，建立转染克隆细胞系。以PCR、RT—PCR和蛋白质印迹法证实外源p53基因的整合与表达。用裸鼠移植瘤试验检测体内致瘤性的影响。结果：野生型p53基因成功的导入胆囊癌细胞系，转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。表达外源wtp53的GBC—SD—wtp53细胞，裸鼠体内致瘤性受到显著抑制。结论：野生型p53基因可有效抑制胆囊癌细胞在裸鼠体内的生长。     

腺病毒介导野生型p53基因对人肺腺癌细胞的抑制效应

目的：p53基因突变是人类肿瘤中常见的遗传学改变。将野生型p53基因导入一些肿瘤细胞中被证明能抑制其细胞增殖，因此做为肺癌基因治疗主要目的基因而备受关注。本研究旨在观察野生型p53基因对人肺腺癌细胞和裸鼠移植瘤的抑制效应，并对其抑癌机制进行分析，为今后肺癌基因治疗的临床试验提供科学依据。方法：采用重组体腺病毒Ad-p53基因转染人肺腺癌细胞系GLC－82；以裸鼠皮下移植瘤治疗试验观察Ad-p53基因的抑瘤效应；用流式细胞计数，DNA片断化及TUNEL分析探讨Ad-p53基因的抑癌机制。结果：导入Ad-p53基因后人肺腺癌GLC－82细胞生长能力显著下降，克隆形成能力受到明显抑制；并显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长；肺癌细胞发生凋亡，并出现明显的G1期阻滞现象。结论：腺病毒介导野生型p53基因（Ad-p53)对人肺腺癌细胞和裸鼠皮下移植瘤均有明显抑制效应，主要通过诱导癌细胞凋亡和参与细胞周期调控实现，进而提示Ad-p53基因有可能在人肺癌基因治疗中发挥重要作用。     

Replacement of the p16 gene in human ovarian cancer cells

目的　研究逆转录病毒介导的p16基因对人卵巢癌细胞系CAOV3生长与致瘤性的抑制作用。方法　用脂质体介导法将外源野生型p16基因转染不表达p16的人卵巢癌细胞系CAOV3,对转染后细胞DNA、RNA和蛋白进行分析并观察其生物学行为变化。结果　外源性野生型p16基因已整合入细胞并获稳定表达 ,表达有外源p16基因的细胞生长速度、集落形成率及裸鼠致瘤性均有部分抑制。细胞周期分析可见G1期增加 ,S期下降。电镜下超微结构出现生长抑制特征。结论　p16基因在卵巢癌发生、发展过程中起重要作用 ,为用p16基因转染对卵巢癌患者进行基因治疗提供了实验依据。     

野生型p53基因对白血病K562细胞的增殖抑制作用

目的:建立携野生型p53基因的K562细胞株,研究该细胞内野生型p53基因的表达并观察其生物学特性。方法:构建重组人p53逆转录病毒载体,导入PA317细胞中进行包装,经过病毒滴度测定,筛选高滴度的产病毒细胞克隆。收集培养上清液中的重组人p53逆转录病毒颗粒,感染K562靶细胞,建立携野生型p53基因的K562细胞株。观察该细胞株的生长方式、形态学和生长速度。SP免疫组化染色法检测p53蛋白表达。进一步用流式细胞仪检测p53蛋白表达率和细胞周期变化;双层软琼脂培养实验检测细胞的增殖潜能改变。以pBabe空载体同时实验,作为各阶段的对照。结果:成功地构建了重组逆转录病毒载体pBabe/p53;获得逆转录病毒生产PA317/p53细胞系,最高病毒滴度为4.64×105CFU/m l;获稳定表达p53基因的K562/p53靶细胞,免疫组化结果证实该细胞内有野生型P53蛋白表达,流式细胞仪检测到野生型P53蛋白表达率为1.32%;与对照K562/pBabe细胞比较,K562/p53靶细胞的生长速度下降;软琼脂集落生成的下降率为27.14±4.49%(P<0.05);增殖指数下降,S期比例下降(P均<0.01)。结论:制备了携p53基因的高滴度逆转录病毒,建立携野生型p53基因的K562/p53细胞株,证实表达的野生型p53蛋白对该细胞有抑制作用。     

野生型p53基因转染对人胃癌细胞系HGC27生长的抑制作用

目的 研究野生型p53基因对人未分化胃癌细胞系HGC27生长的抑制作用。方法 用表达人野生型p53基因全长cDNA的真核载体pcDNA3—p53，转染人未分化胃癌细胞系HGC27，对转染后细胞进行生长曲线、细胞生长抑制率及流式细胞术分析，观察其生物学特性变化。结果 外源野生型p53基因在HGC27细胞内稳定表达，经pcDNA3—p53转染的HGC27细胞生长速度受到明显抑制，流式细胞分析显示G1期增加，S期下降，细胞出现凋亡。结论 野生型p53基因能在HGC27细胞内表达，且能抑制其生长并促进细胞凋亡。     

含野生型p53cDNA重组逆转录病毒的制备

目的：制备野生型p53cDNA重组体的复制缺陷型逆转录病毒。方法：设计引物PCR扩增野生型p53cDNA，用T－A克隆的方法克隆入质粒载体pGEM-T,转化JM109，提取pGEM-T/p53重组体，双酶切得到野生型p53cDNA,然后再克隆人逆转录病毒表达载体pLXSN,转化感受态大肠杆菌 JM109，筛选pL(p53cDNA)SN重组体，脂质体法转染包装细胞AM12，G－418（geneticin)筛选，收集病毒液。结果：通过PCR和重组质粒酶切筛选出重组阳性克隆，收集含pL(p53cDNA)SN重组体的逆转录病毒。结论：含pL(p53cDNA)SN重组体的复制缺陷逆转录病毒可用于转染真核细胞等进一步研究。     

外源性p53基因抑制卵巢癌细胞的增殖并增加其对放疗的敏感性

目的　探讨外源性p5 3基因转染对人卵巢癌细胞系SKOV - 3的生物学行为及放疗敏感性的影响。方法　用脂质体介导的方法 ,将p5 3基因的真核细胞表达载体 (PcDNA -p5 3)导入不表达p5 3的人卵巢癌SKOV - 3细胞中 ,经G4 1 8筛选 ,Northernblot及Westernblot鉴定后 ,观察细胞生长速度、集落形成能力和增殖周期的变化 ;观察p5 3基因转染与放疗联合作用对细胞集落形成的影响。结果　外源性p5 3基因的表达明显抑制了卵巢癌细胞的生长及集落形成能力 ,使细胞阻滞于G1 期。p5 3基因与放疗联合作用明显抑制了卵巢癌细胞的集落形成。结论　外源性p5 3基因能抑制卵巢癌细胞的生长 ,并增加卵巢癌细胞对放疗的敏感性     

脂质体介导的p53基因转染对鼻咽癌细胞作用的研究

目的 通过转染野生型p53基因,观察其对鼻咽癌细胞CNE2生长的影响.方法 将克隆有野生型p53基因的pUHD10-3-p53质粒,用脂质体(lipofectamine)介导的方法转染人鼻咽癌CNE2细胞,以RT-PCR检测p53基因的表达,通过细胞生长曲线、AO/EB染色和流式细胞术等方法对转染细胞的生物学行为进行检测.结果 人鼻咽癌CNE2细胞转染p53基因后,基因在细胞中表达增加,细胞的生长受到抑制,在荧光显微镜下观察到凋亡细胞增多,流式细胞技术显示细胞凋亡率增高.结论 采用脂质体转染野生型p53基因的方法,可抑制人鼻咽癌CNE2细胞的生长,诱导鼻咽癌细胞凋亡.     

外源性p53基因对人胃癌细胞的放射增敏作用

目的:评价外源性p53基因对人胃癌细胞放射敏感性的影响.方法:以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将人野生型p53基因导入不同p53状态的4种人胃癌细胞系,用免疫组化法及Western blot法检测p53基因在胃癌细胞中的表达;用细胞存活份数来表示细胞的生长抑制情况;用流式细胞计数、细胞DNA片段化分析和TUNEL检测细胞凋亡.结果:[ HTSS 在高效靶比病毒剂量下,外源p53基因在4种胃癌细胞的胞核中均高效表达,并可使细胞产生明显的G2/M 阻滞和凋亡,使细胞存活份数明显减少.而且这种作用不依赖细胞内在的p53基因状态.单独照射4 Gy,对野生型p53细胞的生长抑制和致凋亡效应明显,而对其它3种细胞的作用较弱 .照射4 Gy结合Ad-p53时,外源p53基因可显著增强照射引起的G2/M期阻滞和凋亡及生长抑制作用,对4种胃癌细胞放射增效比高达2.3～3.6.结论:腺病毒载体介导的野生型p53基因转染4种胃癌细胞后有明显的放射增敏作用.     

hTERT启动子调控的野生型p53基因对膀胱癌细胞的靶向性抑制作用

目的:探讨人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的野生型p53基因的靶向性表达,观察对人膀胱癌细胞株T24的选择性杀伤效应及细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法,将构建的含hTERT启动子调控表达人野生型p53基因和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,分别转染膀胱癌细胞株T24和正常人胎肺成纤维细胞,应用荧光显微镜、电镜、台盼蓝拒染法及流式细胞仪等方法,观察基因的靶向性表达及对膀胱癌细胞株T24细胞形态学、生长抑制曲线及细胞周期变化的影响。结果:转染hTERT启动子调控的目的基因可在端粒酶阳性的膀胱肿瘤细胞中靶向性表达发出绿色荧光。靶向转染野生型p53基因能抑制膀胱癌细胞生长,72h后细胞生长抑制率分别为48.5%、高于常规培养组3.6%和阴性对照组2.5%,差异有显著性意义(P<0.05)。电镜可见典型的凋亡细胞。细胞周期分析G0和G1期细胞比例明显增高,并出现凋亡峰。结论:构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥靶向性抑制膀胱癌细胞生长作用。     

Retroviral vector containing human p16 gene and its inhibitory effect on Bcap -37 breast cancer cells

目的　研究p16基因对肿瘤细胞生长抑制及细胞周期阻滞作用。方法　将p16cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN构建成p16基因逆转录病毒重组体pLp16SN。利用基因转染方法 ,将pLp16SN及pLXSN导入逆转录病毒包装细胞系PA317细胞 ,获得逆转录病毒。用逆转录病毒感染Bcap 37乳腺癌细胞 ,经G4 18筛选获阳性克隆。利用Northern和Westernblotting方法检测p16基因的表达。检测转基因细胞的生长速度 ,细胞周期及裸鼠成瘤等细胞生物学行为的改变。结果　Northern及Westernblotting显示转染p16基因的Bcap 37细胞p16基因mRNA及蛋白质表达明显增高。此细胞较未转染基因的Bcap 37细胞和转染空载体的Bcap 37细胞生长速度慢 ,G1期细胞比率增高 ,裸鼠接种成瘤体积小。结论　p16基因高表达能够抑制乳腺癌细胞Bcap 37的生长 ,并阻滞细胞从G1期进入S期     

反义寡核苷酸减弱转染p16基因对包装细胞生长的抑制

目的:应用p16(MTS1)反义寡核苷酸抑制转染p16逆转录病毒载体后外源性p16基因的表达,减弱p16表达对包装细胞的生长抑制作用.方法:合成p16 cDNA起始密码子区的反义寡核苷酸和正义寡核苷酸,加入筛选的转染p16逆转录病毒载体的包装细胞培养液中,记录各孔中出现细胞克隆的时间和数量,测量各形成细胞克隆的病毒上清滴度.Western blot 检测反义寡核苷酸对外源性P16蛋白表达的影响.MTT法检测加入反义寡核苷酸后对转染的包装细胞生长的影响.结果:p16(MTS1)反义寡核苷酸可以抑制外源性p16基因的表达.加入反义寡核苷酸的包装细胞形成细胞克隆的时间提前,克隆数量和滴度都高于对照组.结论:p16(MTS1)反义寡核苷酸可以抑制外源性p16基因的表达,促进p16逆转录病毒载体转染的包装细胞的生长并提高病毒滴度.     

p16和p53基因及顺铂联用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用

目的：探索p16基因和p53基因及p16基因和顺铂（CDDP）联合应用对体内外胆管癌细胞系生长的抑制作用。方法：将重组体腺病毒p16（Ad-p16）和Ad-p53及Ad-p16和CDDP联合作用于人胆管癌细胞系QBC939，观察和分析其对体内外胆管癌细胞生长抑制作用及其机制，结果：Ad-p16在QBC939细胞中表达能抑制QBC939细胞的生长，与p53、CDDP联合应用能明显抑制QBC939细胞的生长，p16和p53基因诱导癌细胞发生G1期阻滞和细胞凋亡，CDDP能诱导癌细胞发生G2期阻滞和细胞凋亡；裸鼠皮下移植瘤模型瘤体内注射Ad-p16及腹腔内注射CDDP均能抑制QBC939肿瘤的生长，两者联合应用具有协同作用。结论：p16基因和p53基因及CDDP联合应用具有协同作用。     

转染野生型p53基因对人肝癌细胞生长的抑制作用

目的 研究转染野生型p53基因对人肝癌细胞的生长影响作用。方法 将克隆有野生型p53基因的pUHD10-3质粒,通过Lipofectin转染肝癌细胞株BEL-7402、BEL-7404、HLE、HUH-7及SMMC-7721,用四甲基偶氮唑(MTT)法观察细胞的生长情况。结果 转染野生型p53基因,可使肝癌细胞BEL-7404、HLE、HuH-7的生长明显受到抑制,第4天生长抑制率分别是50．0％、69．0％及65．1％。结论 转染野生型p53基因能有效抑制肝癌细胞株BEL-7404、HLE、HuH-7的生长。