乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定

目的探讨和建立适用于乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。方法乳小鼠心脏剪成组织块,用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶联合消化法分离细胞,再通过差速贴壁分离法分别收集、培养乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞。光学显微镜下分别观察成纤维细胞和心肌细胞的基本形态特征的变化,并对2种细胞行苏木素-伊红(HE)染色,用第2代心肌成纤维细胞行波形蛋白免疫荧光鉴定,而原代心肌细胞行α-横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白和心肌肌球蛋白重链免疫荧光鉴定。结果差速贴壁分离法心肌成纤维细胞原代培养90 min基本贴壁,贴壁较早,培养第3～5代细胞生长良好,72 h心肌成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定纯度高达97%;而心肌细胞贴壁较晚,24 h贴壁后部分心肌细胞出现自发性搏动现象,48 h后细胞逐渐展开,72 h后逐渐形成细胞簇并出现同步搏动,心肌肌球蛋白重链、心肌横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白免疫荧光鉴定心肌细胞纯度分别为95%、93%、95%。结论差速贴壁分离法结合免疫荧光鉴定可分离乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞,此方法成熟、稳定、有效,为研究心脏疾病的基础与临床研究提供了理想的实验模型。     

新生小鼠心脏细胞体外共培养体系的建立及其在心肌细胞增殖研究中的应用

目的 建立新生C57乳鼠心肌细胞和成纤维细胞体外原代培养和共培养体系,探讨不同日龄乳鼠心脏细胞的体外增殖特征.方法 分离不同日龄C57新生小鼠的心肌细胞和成纤维细胞,分别进行原代培养和共培养,观察细胞的形态和活力变化,测定CyclinD1、CDK4、GATA4、Nkx2.5以及FGF1的表达.结果 差速贴壁90 min后成纤维细胞先贴壁,培养12h后心肌细胞几乎全部贴壁;共培养心肌细胞多以细胞团的形式贴壁生长.出生5d以内的乳鼠心肌细胞数量明显增加,共培养的心肌细胞活力更大、增殖速度快;出生5d以后乳鼠的心肌细胞数量变化并不明显.出生5d内乳鼠心肌细胞中CyclinD1和CDK4的表达量较高,且共培养的心肌细胞表达量要高于单独培养的心肌细胞表达量.GATA4、Nkx2.5和FGF1的表达随日龄增大而增加.结论 成功建立了新生小鼠心肌细胞和成纤维细胞的体外共培养体系;出生5d内的乳鼠心肌细胞体外培养时具有较强的增殖能力,且成纤维细胞能促进心肌细胞的增殖,GATA4、Nkx2.5和FGF1有阻止心肌细胞增殖作用.出生5d后乳鼠的心肌细胞增殖能力减弱甚至消失.     

原代心肌细胞培养

目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察。方法:取出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度。结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92%,纯度90%,2～3 d出现同步搏动。结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好。     

SD乳鼠原代心肌细胞培养方法的改进

目的:探讨SD乳鼠原代心肌细胞最佳分离、纯化及培养方法,以提供可靠的心肌细胞模型。方法:用含0.1%的胰蛋白酶及0.1%Ⅱ型胶原酶的酶混合液分离乳鼠心脏组织,并用差速贴壁分离法和5-溴脱氧尿核苷抑制法进行纯化,用台盼蓝染色法检测细胞的存活率,倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化,免疫组织化学染色方法检测心肌细胞的纯度。结果:台盼蓝染色观察细胞存活率达(96.9±8.9)%以上。显微镜下心肌细胞由圆形渐变为梭形、多边形,逐渐形成细胞簇,搏动频率约120～150次/min。用抗横纹肌肌动蛋白单克隆抗体鉴定心肌细胞,阳性率为(90.5±1.6)%。结论:本方法所获SD乳鼠的心肌原代细胞纯度高、活力强。     

The culture of primary cardiac cells

目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察.方法:取出生1～3d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度,结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92％,纯度90％,2～3d出现同步搏动.结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好.     

新生大鼠心肌细胞体外培养及其与心肌成纤维细胞形态比较

目的探索一种快速分离和培养新生大鼠心肌细胞的方法,比较心肌细胞和成纤维细胞的形态差异。方法胰蛋白酶消化法分离新生大鼠心肌细胞进行体外培养,差速贴壁法纯化心肌细胞,倒置显微镜跟踪观察心肌细胞的生长及搏动情况,台盼兰负染法检测心肌细胞活力,通过HE染色观察心肌细胞和成纤维细胞的形态学差异。结果接种24 h后细胞全部贴壁,部分细胞开始自发性搏动,48 h后,细胞体积增大,并伸出伪足,形状以三角形和梭形为主,3 d后细胞聚集成片并同步搏动且细胞活力均在90%以上。心肌细胞为梭形或三角形,胞质致密,多为单核细胞;心肌成纤维细胞呈泡状,双核和三核细胞较多,培养过程中不发生搏动。结论胰蛋白酶消化法培养新生大鼠心肌细胞快速有效,差速贴壁法纯化的心肌细胞可用于实验研究。     

miR-1、miR-16和miR-208前体在乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞中的表达

目的检测心肌特异的miR-1、miR-16和miR-208前体在乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中的表达。方法利用出生1～3d的Sprague-Dawley(SD)大鼠和C57BL/6小鼠,采用2.5%胰酶消化和差速贴壁法分离心肌细胞和心肌成纤维细胞。提取原代的乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及P1代的心肌成纤维细胞总RNA,以β-actin为内参照,逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)分别检测miR-1、miR-16和miR-208的前体表达水平。用FluorChem8900软件分析琼脂糖凝胶电泳后PCR产物条带的灰度值,计算出表达的目的miRNA前体与β-actin的比值。结果有效分离并培养了乳C57BL/6小鼠、乳SD大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞。RT-PCR结果显示,在乳SD大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中miR-1和miR-16均有相近水平的表达;心肌细胞中miR-208的表达显著低于miR-208b(P0.01),miR-208b在心肌细胞中的表达显著高于其在心肌成纤维细胞中的表达(P0.05)。乳C57BL/6小鼠心肌细胞中miR-1a-1的表达显著低于miR-1a-2(P0.01),而miR-1a-2在心肌细胞和心肌成纤维细胞中的表达水平一致;miR-16-1在心肌细胞和心肌成纤维细胞中表达水平相近,而miR-16-2在两种细胞中均不表达;心肌细胞中miR-208a和miR-208b表达水平差别不明显,心肌成纤维细胞中只有miR-208a表达,并且在水平上低于其在心肌细胞中的表达(P0.05)。结论 miR-1、miR-16和miR-208前体在乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中呈细胞特异性的表达。     

心肌细胞二维培养的纯化和鉴定

目的探讨新生大鼠心肌细胞二维培养过程中心肌细胞的纯化及心肌细胞与成纤维细胞的鉴别,为改进心肌细胞二维培养及心肌细胞三维培养提供依据。方法用不同差速贴壁次数、含Brdu培养心肌细胞,免疫荧光标记后用激光共聚焦显微镜分别对24h的细胞进行分析鉴定。结果不同培养方法对心肌细胞的纯化有影响。结论差速贴壁次数的不同得到的心肌细胞纯度不一样,加入适当浓度的Brdu可抑制成纤维细胞的生长,获得纯度更高的心肌细胞。     

小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养

目的:观察原代培养的小鼠乳鼠心肌细胞的形态特征。方法:Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶消化心脏组织,差速贴壁分离法。结果:12 h心肌细胞基本贴壁,第2天可长成单层,第3~4天细胞伸出伪足相互接触交织成网,逐渐形成细胞簇或细胞单层,搏动呈同步性,收缩明显有力,搏动频率为30~120次/min。结论:用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分离培养小鼠乳鼠心肌细胞可获得形态、活力良好的心肌细胞。     

新生大鼠心肌细胞原代培养方法

目的探讨乳鼠心肌细胞的原代培养方法,更好地获取高存活率、高搏动率及高纯度的心肌细胞,以建立良好的原代心肌细胞研究模型。方法无菌状态下取出生3 d以内Wistar乳鼠心室肌,以混合消化酶（0.06%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶均量混合液）反复进行短时间多次消化,用差速贴壁法纯化心肌细胞,并加入5-溴脱氧尿嘧啶抑制非心肌细胞分裂增殖,2 d后首次换液,以后隔日换液。结果心肌细胞24 h左右已基本贴壁,并可见单个细胞搏动,2～6 d形成单层心肌细胞和其细胞簇的同步搏动,经培养所获细胞搏动良好,存活率高,免疫组化鉴定显示培养的心肌细胞纯度95%以上。结论该方法是一种较为理想的乳鼠原代心肌细胞培养方法,值得进一步推广。     

东方田鼠皮肤成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的 探索和建立东方田鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性。方法采用含10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle培养液(DMEM)和1640两种培养体系,运用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1 、3 d和5 d的东方田鼠乳鼠皮肤成纤维细胞进行原代分离、培养。苏木素-伊红染色及倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态和生长特性。结果0.25%胰酶消化分离出生后1 d和3 d东方田鼠乳鼠皮肤较出生后5 d组织可获得较多数量细胞,成纤维细胞在体外快速贴壁生长,一般6 ～7 d长满培养瓶,细胞纯度高,HE染色细胞呈长梭形,胞核明显；DMEM和1640两种培养液均可用于东方田鼠皮肤成纤维细胞的培养,但细胞传代后生长趋缓,只可传代2～3次。本实验运用组织块贴壁法未能培养出皮肤成纤维细胞。结论确定了有效分离东方田鼠皮肤成纤维细胞的日龄和方法,为进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

Balb/c乳鼠心肌细胞的分离和体外培养方法的优化

目的 探讨Balb/c乳鼠心肌细胞分离和培养方法,优化出Balb/c乳鼠心肌细胞分离和培养的方法.方法 取乳鼠心脏,采用胰酶和胶原酶Ⅱ消化方法分离乳鼠心肌细胞,比较消化次数和消化时间对原代乳鼠心肌细胞培养的影响.结果 原代培养的Balb/c乳鼠心肌细胞生长迅速、自行搏动,细胞形态完整,细胞内肌丝、线粒体清晰.分离细胞时消化次数最好控制在不多于6次,每次消化时间不超过20min.2h差速贴壁可以提高心肌细胞纯度,经肌动蛋白鉴定,心肌细胞达94.6%.结论 本研究优化了分离和原代培养Blab/c乳鼠心肌细胞的方法.     

乳小鼠心肌细胞体外培养方法的优化

目的探讨乳小鼠心肌细胞分离和体外培养的方法,并结合实际情况建立一种优化的体外培养乳小鼠心肌细胞的方法。方法胰酶-Ⅱ型胶原酶混合液分次消化乳小鼠心肌组织后行差速贴壁法达到心肌细胞纯化目的,并利用心肌细胞特意表达a-肌动蛋白的特性运用细胞免疫组织化学方法鉴定心肌细胞。结果差速贴壁48h后心肌细胞贴壁完全,并见大部分贴壁细胞出现搏动,但未观察到同簇搏动,经a-肌动蛋白细胞免疫组织化学鉴定,心肌细胞纯度达96.7%。结论本研究优化了原代乳小鼠心肌细胞分离和体外培养方法,为后续细胞实验打下了基础。     

不同浓度胎牛血清对原代心肌成纤维细胞增殖及分化的影响

目的: 探讨不同浓度胎牛血清体外培养对原代心肌成纤维细胞增殖和分化的影响。方法: 用酶消及差速贴壁法分离并培养SD乳鼠心肌成纤维细胞;采用不同浓度胎牛血清（1%、5%、10%和20%）培养心肌成纤维细胞并观察细胞形态,免疫荧光共聚焦法检测α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）蛋白表达,划痕实验检测心肌成纤维细胞的迁移能力,CCK8实验检测心肌成纤维细胞的增殖能力。结果: 随着胎牛血清浓度升高,细胞形态逐渐变圆,细胞表面积增加,α-SMA阳性细胞比例增加,心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化增多,细胞迁移能力增加。高浓度胎牛血清（20%）培养时心肌成纤维细胞增殖能力最旺盛,低浓度胎牛血清（1%）培养时心肌成纤维细胞增殖能力最低,5%和10%胎牛血清培养时心肌成纤维细胞增殖均旺盛。结论: 高浓度胎牛血清培养会导致心肌成纤维细胞分化,5%胎牛血清培养心肌成纤维细胞较10%和20%胎牛血清培养分化程度少,增殖能力较1%胎牛血清好,选用5%胎牛血清培养心肌成纤维细胞较好。     

新生大鼠心肌细胞分离与原代培养

目的 应用酶消化法消化心肌组织、培养心肌细胞.方法 0.1%的胰蛋白酶重复消化乳鼠心肌组织多次,收集的细胞用含15%胎牛血清的MEM培养基混悬后过滤,纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育.结果 培养的心肌细胞4～6 h后开始贴壁生长,12～24 h明显增殖,3～4 d后细胞汇合成片.在倒置显微镜下心肌细胞呈圆形、梭形、多角形,伸出伪足,出现自发性节律性搏动.结论 应用酶消化法可简便、快速地获得大量活力高的心肌细胞.     

不同消化方法对心肌成纤维细胞体外培养影响

目的对比不同消化方法对原代乳鼠心肌成纤维细胞体外培养的影响,探求更高效的细胞分离、培养方法。方法改良既往文献报道的心肌成纤维细胞分离方法,选用胶原酶、胰酶、胶原酶加胰酶消化液分别对同等数量随机挑选的同窝出生1～2 d的SD乳鼠进行心肌成纤维细胞分离,从细胞数量及活性、细胞增殖、细胞纯度及对中药、西药反应灵敏度等方面对分离出的第0代(P0)细胞及传代至第2代(P2)的细胞进行比较。结果胶原酶消化法分离所得细胞在数量、成活率、贴壁速度、增殖速度方面,明显优于胰酶消化法或胶原酶加胰酶消化法,P0.05,差异有统计学意义;在形态学上并无明显差异,且细胞纯度均可达到95%;胶原酶消化法所得细胞对中药、西药灵敏度较高,P0.05,差异有统计学意义。结论选用胶原酶作为原代乳鼠心肌成纤维细胞的消化酶,运用时间梯度消化细胞,可以高效得到数量多、活性好、纯度高、对药物反应灵敏的细胞。     

SD乳鼠心肌细胞原代培养及纯化方法的优化探索

目的 通过对乳鼠心肌细胞原代培养及纯化方法的优化探索,寻找简单、有效的培养及纯化方法。方法 20只乳鼠随机分两组,A组采用酶消化法+吸管吹打获取心肌细胞;B组通过酶消化法+自制转子磁力搅拌获取心肌细胞。两组均采用差速贴壁和5-溴脱氧尿核苷（BrdU）纯化心肌细胞,免疫荧光法鉴定心肌细胞纯度,台盼蓝染色观察心肌细胞活性,显微镜下计数心肌细胞搏动性。结果 A组心肌细胞的存活率、搏动率、纯度分别为（89.90±2.92）%、（91.30±2.00）%和（94.90±1.79）%; B组分别为（94.70±2.31）%、（95.00±1.24）%和（95.60±1.43）% 。B组心肌细胞活性及搏动率均高于A组,差异有统计学意义(\P>0.05);B组的心肌细胞纯度稍高于A组,但差异无统计学意义(\P>0.05)。BrdU加入后与未加入相比,抑制成纤维细胞的生长。结论 酶消化法+自制转子磁力搅拌更优于酶消化法+吸管吹打,可以有效获取心肌细胞,BrdU有利于心肌细胞的纯化。     

原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定

目的建立原代乳小鼠心肌细胞的培养方法,评价心肌细胞的存活状况并鉴定心肌细胞纯度。方法应用胰酶联合胶原酶共同消化3d内C57乳小鼠心脏,台盼蓝染色判断心肌细胞存活率,α-actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度。结果利用3d内乳鼠心脏可成功培养原代小鼠心肌细胞,台盼蓝染色显示细胞存活率大于95%,α-actin免疫荧光染色显示心肌细胞纯度达95%以上。结论严格控制实验条件,可成功培养高存活率和高纯度的小鼠心肌细胞。     

大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的分离培养及鉴定

探讨大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞体外分离及培养的方法.采用0.125％胰酶多次消化法收集新生SD大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞.高内涵细胞成像法检测细胞增殖能力,免疫荧光、Western blot和RT-PCR法检测波形蛋白表达水平,CD90标记成纤维细胞、鉴定细胞纯度.最新消化分离得到的细胞呈亮球形,轮廓清晰,单个散在或聚集成团分布,90 min后即有大量细胞贴壁,其中部分细胞已开始伸展.5～6 d可形成单层细胞,传代后的细胞呈长纺锤形或多边形.波形蛋白表达呈强阳性.传代3代的细胞培养体系中成纤维细胞约占87％.含5％FBS的DMEM/F12培养基培养24 h即可检测到细胞的大量增殖.胰酶消化法是获得大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的有效方法.     

新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良

目的:探讨更为简便的新生大鼠心肌细胞原代培养的方法,使分离的心肌细胞达到理想的数量、存活率和纯度.方法:用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化,分离新生大鼠心肌细胞,进行体外培养,观察心肌细胞形态学变化,并以细胞免疫荧光进行心肌细胞纯度鉴定.结果:心肌细胞分离良好,收获细胞数量及存活率高,可贴壁搏动生长,免疫荧光显示培养的心肌细胞纯度达95%以上.结论:改良的细胞培养技术可获得生长状态良好的心肌细胞.