半乳糖基多聚赖氨酸携带HSV1-TK对HepG2细胞体外效应研究

目的为肝癌的自杀基因治疗寻找新的靶向分子方法通过还原氨化法进行乳糖（Lac）与聚赖氨酸（PLL）共价连接；经Sephadex G-10枉分离纯化；以苯酚-硫酸比色法测定n值；与真核表达质粒r-pAs16Dr按比例混匀，得到GlanPLL-r-pAs16Dr基因转移系统；分别转染不同的细胞株进行体外效应研究：人肝癌细胞株HepC2、人肺癌细胞株549，观察报告基因红色荧光蛋白能否在肝细胞中表达；RT—PCR检测HSV—tk基因的表达情况；观察给予不同浓度的更昔洛韦（GCV）后随时间延长细胞改变情况，用MTT法检测GCV对不同细胞的杀伤作用。结果化学合成得到34个半乳糖基的PLL；转染后48h在HepG2可见红色荧光蛋白表达，A549细胞未见红色荧光蛋白表达；RT-PCR证实HSV—tk仅在HepG2细胞中表达：体外杀伤实验显示：经GlanPLL-r-pAs16Dr基因转移系统处理的两种细胞对GCV表现出不同的敏感性HepG2细胞对GCV很敏感，低浓度的GCV（1mg／L）处理3d．即可使细胞生长抑制率达到70．5％，A549对GCV不敏感结论半乳糖基多聚赖氨酸能够与ASGPR有效的结合，合成配体来源丰富、制备简单，适合于作为自杀基因HSV—tk肝靶向运送的导向配体。     

自杀基因HSV-tk体外抗小鼠黑色素瘤细胞B16的作用

目的研究自杀基因HSV-tk体外对小鼠黑色素瘤B16细胞杀伤作用与前体药物的相关性。方法以脂质体将质粒PCMV-TK-IRES-EGFP转染至B16细胞,分别加入浓度为:0、10、30、50 ug/ml的HSV-tk的前体药物环氧鸟苷(GCV),用MTT法检测对B16细胞的抑制作用。结果质粒PCMV-TK-IRES-EGFP对B16细胞的杀伤作用随药物GCV的浓度上升而增加,在GCV为50 ug/ml时,杀瘤效应为46.96%,各组别间差异具有显著性。结论自杀基因HSV-tk对小鼠黑色素瘤B16细胞具有杀伤作用,该作用随前体药物GCV浓度增加而增强。     

腺病毒介导PTEN基因抑制肝癌体外生长和侵袭力的研究

目的探讨腺病毒介导PTEN基因对肝癌细胞株H22体外生长和侵袭力的影响。方法以Ad-PTEN、Ad-PTEN^G-129R质粒及空载质粒分别转染体外培养肝癌细胞株H22，并以来转染组为对照，用RT-PCR检测目的基因，用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测细胞活力，通过Boyden小室法检测肝癌细胞株H22体外侵袭力的变化。结果RT-PCR显示Ad-PTEN-H22组、Ad-PTEN^G-129R-H22组的H22细胞相应基因mRNA表达呈阳性条带，表明有PTEN和PTEN^G-129R的表达；在细胞活力检测上，Ad-PTEN-H22组550nm波长光吸收值为0.5627±0.0633，表明该组活细胞数明显低于其他各组（P〈0．05）；Ad-PTEN-H22组的侵袭细胞数为（15.64±3．27）％，低于其他组（P〈0.05）。结论重组腺病毒载体介导的PTEN基因转染可抑制肝癌细胞株H22体外生长并且其体外侵袭力受到明显抑制。     

全长型人Smac基因真核表达载体构建及表达

目的 构建全长型(full length,FL)人Smac基因(hSmac)真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中表达.方法 应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人宫颈癌细胞株Hela中扩增到Smac CDs基因片段,构建重组真核表达载体peDNA3.1 -FL hSmae.PCR、酶切鉴定重组质粒正确后,通过脂质体介导将其和作为阴性对照的空载体pcDNA3.1 分别转染人肝癌细胞株(SMMC-7721).同时转染含EGFP的质粒pcDNA3.1 -EGFP.利用荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率.采用RT-PCR、western blot法检测外源基因Smac的表达.结果 PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人Smac基因克隆成功.且鉴定证实真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac构建成功.流式细胞术检测到转染效率高达48%,荧光显微镜下也可见非常明亮的绿色荧光.无论是在mRNA水平还是蛋白水平上,转染后的细胞中外源基因Smac表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中明显表达,为研究Smac基因在细胞凋亡过程中的调控作用.以及探讨以Smac基因为基础的肿瘤基因治疗策略提代基础依据.     

人端粒酶逆转录酶调控的CD基因对卵巢癌细胞株的选择性杀伤作用研究

[目的]构建人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)调控下的自杀基因—胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶/5-氟胞嘧啶(CD-TK/5-FC)系统对人卵巢细胞及正常细胞株的体外杀伤作用。[方法]应用脂质体转染法将hTERT核心启动子启动质粒pBTdel-279转染人卵巢癌细胞系3AO、正常卵巢上皮细胞(NOEC)和人胚肺成纤维细胞株HELF,用荧光素酶分析检测hTERT启动子活性;应用RT-PCR技术检测hTERTmRNA的表达水平;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及流式细胞仪检测pBTdel-279-CD-TK/5-FC系统和pcDNA3-CD-TK/5-FC系统对上述3种细胞不同的杀伤作用;利用RT-PCR技术检测转染前后3AO和NOEC细胞中CD和TK基因的不表达情况。[结果]卵巢癌细胞系3AO中hTERT启动子活性增高,为23.2%,与pBTdel-279-TK/GCV系统作用相比,pBTdel-279-CD-TK/5-FC+GCV系统对端粒酶阳性的卵巢癌细胞系3AO的杀伤作用显著增强,对于端粒酶阴性正常细胞NOEC和HELF则无杀伤作用;pcDNA3-CD-TK转染后,3种细胞中均可检测到CD和TK基因;pBTdel-279-TK转染后,3AO可检测到CD和TK基因,正常细胞中则呈阴性。[结论]人端粒酶逆转录酶启动子调控下的CD自杀基因对卵巢癌细胞株选择性杀伤作用治疗是一种高效、靶向的卵巢癌基因治疗方式。     

Adr亚型乙型肝炎病毒转染细胞模型的构建

目的建立乙型肝炎病毒（HBV）复制状态的细胞模型。方法利用分子亚克隆技术。将9600bp的adr亚型HBV全基因克隆至pcDNA3的EcoRI和HindⅢ位点构建pcDNA3—3HBV，通过脂质体介导的方法转染HepG2细胞，G418筛选。结果成功构建了质粒pcDNA3—3HBV，稳定转染后培养上清，ELISA检测结果显示，HBSAg、HBeAg阳性，且PCR检测前S／S基因阳性。PCR证实转染细胞中有HBVcccDNA存在，RT—PCR证实HBVS基因mRNA的表达。结论重组质粒pcDNA3．3HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制。     

不同前药联合HSV-tk自杀基因系统对喉癌细胞体外杀伤效应的比较研究

目的：观察并比较不同前药与自杀基因HSV－tk共同作用对喉癌细胞Hep-2的体外杀伤作用。方法：构建tk基因逆转录表达载体pL(tk)SN，在LipofectAMINETM2000介导下转染PA317包装细胞，G418筛选，直至出现抗性克隆，扩大培养，用NIH3T3测定病毒滴度，将重组病毒分别感染人喉癌细胞Hep-2,G418筛选出抗性克隆命名为Ｈep/tk，以RT－PCR及Southern blot检测tk基因的整合及表达。通过观察tk基因修饰细胞生长状况及比较不同前药对喉癌细胞杀伤效应以探讨不同前药作用机理。结果：RT－PCR及Southern blot分析证明tk基因在人喉癌细胞系Hep-2中有整合及表达；Hep/tk与未转基因的原肿瘤细胞相比，二者生长速度及形态结构无明显差别；在不同前药敏感性试验中，Hep/tk显示出对GCV的高敏感性，而tk阳性和tk阴性细胞均显示对ACV和BVdU相对不敏感，tk基因修饰细胞与不同比例亲本细胞混合后经GCV治疗均显示出明显旁观者效应。结论：人喉癌细胞系Hep-2对HSV－tk/GCV系统高度敏感，并且有明显的旁观者效应，可望成为喉癌基因治疗的新途径。     

硅纳米载体携带RNA干扰质粒逆转人结肠癌细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨硅纳米颗粒作为基因转染载体携带干扰质粒MRP2siRNA逆转人结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP的多药耐药,为硅纳米作为靶向基因治疗和化疗药物的有效性打下基础. 方法 制备硅纳米载体,用硅纳米载体和脂质体分别将多药耐药基因MRP2的干扰重组质粒pGensil-MRP2siRNA,转染人结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP,观察两种载体转染人结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP后绿色荧光的表达,利用RT-PCR和Western-blot检测MRP2的表达,CCK-8实验测定转染干扰质粒后顺铂对人结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP细胞增殖抑制作用,并比较两种载体的逆转效率. 结果 在人结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP中,两种载体携带的siRNA都明显抑制了MRP2 mRNA及蛋白的表达,两种载体逆转效果差异无统计学意义（P＞0.05）.在相同浓度化疗药物的作用下,两种载体的RNA干扰组细胞凋亡比例显著高于对照组（P＜0.01）,表明细胞耐药性显著下降,两种载体细胞凋亡差异无统计学意义（P＞0.05）. 结论 硅纳米能有效的携带pGensil-MRP2siRNA质粒转染人结肠癌细胞人结肠癌耐药细胞株HT29/L-OHP,并且对结肠癌耐药细胞的MRP2的表达有明显抑制作用,取得良好的逆转耐药效果.     

含信号肽的Mtb8.4/hIL12嵌合基因真核表达质粒的构建及在COS-7细胞中的表达

[目的]克隆结核分枝杆菌含信号肽的Mtb8.4（MS）/hIL12嵌合基因,导入真核表达载体pCI-neo,并在COS-7细胞中进行表达。[方法]首先以pcDNA3.1（＋）-含信号肽的Mtb8.4（pMS）为模板,经聚合酶链反应（PCR）扩增出MS-linker基因,与pCI-neo载体进行连接重组,构建成pCI-neo-MS-linker（pMSL）重组质粒,然后以pORF-hIL12质粒为模板,经PCR扩增出hIL-12基因,将hIL-12基因与pMSL质粒进行连接重组,构建成MS/hIL12嵌合基因真核表达质粒,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等多种分子生物学方法进行鉴定;重组嵌合质粒转染COS-7细胞后,用RT-PCR方法鉴定MS/hIL12嵌合基因在转录水平的表达情况。[结果]MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功;转染COS-7细胞后,MS/hIL12嵌合基因在转录水平成功表达。[结论]MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建及在COS-7细胞中的成功表达,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病MS/hIL12嵌合基因疫苗奠定了基础。     

鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达

目的构建鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染性克隆,通过体外细胞转染获得单一来源、基因序列清楚的体内实验的感染毒种。方法以湖北麻鸭DHBV分离株（DQ276978）为模板,用PCR法从该DHBV全基因组克隆质粒（pMD-DHBV）和DHBV阳性血清中获取3部分基因片段,总长4.4kb,克隆至载体PCR2.1的SacI和NotI酶切位点,构建含1.5倍鸭乙型肝炎病毒全基因的重组质粒,并酶切鉴定其插入方向。将构建的重组质粒经脂质体Lipo-fectineTM 2000导入鸡肝癌细胞系（LMH）细胞中转染表达,收集纯化后的转染细胞培养上清液作为体内实验感染的标准毒种。结果PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定,证实成功获得正向插入的1.5倍鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒PCR2.1-DHBV1.5。Southernblot检测表明,该重组质粒在LMH细胞内存在各种病毒复制中间体;通过电镜观察,转染细胞上清液中存在DHBV完整病毒颗粒。结论经体外重组,构建出携带1.5倍加长DHBV基因组片段的重组质粒PCR2.1-DHBV1.5,并可在鸡肝癌细胞LMH中介导高水平病毒复制,从而获得含可自我复制病毒颗粒的转染细胞上清液作为动物体内感染接种物。     

帕金森病PINK1蛋白真核表达载体pcDNA3．1-myc／PINK1的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3．1-mye／PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达。方法用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA,该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1-myc—his（-）B上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48h后利用RT—PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。主要观察指标：（1）PINK1基因cDNA扩增产物检测。（2）pcDNA3．1-myc／PINK1重组体酶切鉴定。（3）Western—blotting。结果经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3．1-myc／CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48h后的COS-7细胞可检测到PINK1蛋白的表达。结论PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达。     

人乳头瘤病毒11型E7与共刺激分子CD80嵌合DNA疫苗质粒的构建及鉴定

目的:构建人乳头瘤病毒11型(HPV ll)E7与共刺激分子CDS0嵌合DNA疫苗质粒。方法:从尖锐湿疣病变组织中提取DNA制备模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HPV ll-E7基因,经双酶切后定向克隆到pcDNA3.1(+)中,获得pcDNA3.1(+)/HPV llE7,测序鉴定后,再用PCR方法扩增去除终止密码子的E7基因片段,按上述方法插入质粒pcD-NA3.1(+)/CD80中CD80上游,构建pcDNA3.1(+)/HPV llE7-CD80融合基因真核表达质粒。结果:去除终止子的E7基因片段成功正向插入CD80上游,双向测序分析显示序列无误,pcDNA3.1(+)/HPV llE7-CD80嵌合真核表达质粒构建成功。结论:HPV ll-E7/CD80嵌合DNA疫苗质粒构建成功,为研究该疫苗在尖锐湿疣防治中的作用奠定了基础。     

过表达GCNF对HeLa细胞生物学行为的影响

目的:将成功构建的人pcDNA3.1-GCNF真核表达载体瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,观察GCNF基因对HeLa细胞生物学功能的影响。方法:将重组质粒pcDNA3.1-GCNF转染HeLa细胞,通过MTT比色法、基质胶黏附实验和Transwell侵袭试验对转染后HeLa细胞增殖、黏附和侵袭力进行分析。结果:成功获得瞬时转染的pcDNA3.1-GCNF HeLa细胞,转染目的基因组(0.239±0.014)与转染空质粒组(0.198±0.020)及未转染组(0.204±0.012)相比,细胞增殖最快(P<0.05)。转染目的基因后细胞粘附、侵袭力未见明显改变。结论:GCNF基因促进了体外培养的宫颈癌HeLa细胞增殖,但对HeLa细胞粘附、侵袭力没有明显的影响。     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。     

乙肝病毒preS1基因与截短C基因真核表达载体构建及表达

目的建立乙型肝炎病毒（HCV）preS1基因与截短C基因真核表达载体，并在CHO细胞中瞬时表达。方法PCR方法扩增HBV核心区羧基端部分缺失的基因片段和preS1全基因，克隆入真核表达载体pcDNA3．1（-）后测序鉴定，并通过脂质体瞬时转染CHO细胞。结果构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-Ct-preS1，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT—PCR证实pcDNA3．1（-）-Ct-preS1在CHO中表达截短的核心基因和preS1基因融合蛋白。结论成功构建preS1基因与截短C基因真核表达载体，可在CHO细胞中瞬时表达，为深入研究HBV基因免疫奠定了基础。     

hMAM与人HSP70融合基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)与人热休克蛋白70(hHSP70)融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,经酶切测序分析后,与人HSP70基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建了融合基因真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70。将重组载体电穿孔法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达。结果:成功扩增了人HSP70基因与hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM与人HSP70的融合基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM与人HSP70融合基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3-Rv3873，并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆至原核载体pGEx-4T-1中，经测序鉴定后，将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建重组子pcDNA3．1-Rv3873，通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100％，限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3．1（＋）中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体，为进—步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1（＋）-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。     

真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1的构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的构建pcDNA3．1－RASSFl真核表达载体,并检测其对肝癌细胞系HepG2凋亡的影响。方法应用聚合酶链反应技术从人RASSFlcDNA中扩增出RASSF1基因后,以内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切,将其克隆人用相同酶处理的载体pcDNA3．1;将重组质粒pcDNA3．1－RASSF1转染肝癌HepG2细胞,应用Westernblot法检测RASSF1的表达水平;用AnnexinV／PI法检测细胞的凋亡情况。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3．1．RASSF1构建成功;Westernblot法结果表明转染pcDNA3．1-RASSF1后HepG2细胞中RASSFl表达升高;AnnexinV／PI法用流式细胞术检测凋亡,空白组、pcDNA3．1组和pcDNA3．1-RASSFl组HepG2细胞的凋亡率分别为（5．8±0．42）％、（7．48±0．68）％和（35．1±3．15）％。结论真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1构建成功;RASSF1蛋白在HepG2细胞中高表达,并促进细胞凋亡。     

人乳腺珠蛋白基因疫苗的构建及其免疫原性研究

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因重组质粒pcDNA3.1-hMAM,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序后克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM。将重组载体脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA检测目的基因的表达。结果:成功扩增hMAM基因,酶切测序表明,重组质粒含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM基因疫苗构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。