核转录因子-κB通路在CD40-CD154诱导血管内皮细胞活化中的作用

目的 探讨血管内皮细胞(VEC)内核转录因子-κB(NF-κB)通路在CD40-CD154相互作用诱导VEC活化中的作用.方法 应用重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)和重组人γ干扰素(rhIFN-γ)刺激人主动脉VEC,通过流式细胞仪(FACS)检测CD40和粘附因子表达水平;通过表达CD154的细胞株D1.1和VEC共同培养后,观察VEC粘附因子的表达水平;通过抗CD154单克隆抗体阻断CD40-CD154间的反应;应用NF-κB阻断剂BAY11-7082观察阻断NF-κB通路后对CD40-CD154诱导VEC活化的影响.结果 未活化的VEC膜表达低水平的CD40、CD54和CD106,但不表达CD62E,经白细胞介素刺激后可上调这些蛋白分子的表达水平.D1.1细胞株和VEC共同培养后可诱导VEC活化并上调CD62E、CD54和CD106的表达水平;抗CD154抗体可阻断CD40-CD154间的反应所诱导的VEC活化;NF-κB阻断剂可阻断rhTNF-α诱导的VEC活化以及CD40-CD154间的反应所诱导的VEC活化.结论 VEC中CD40和T淋巴细胞中CD154之间的相互作用在诱导VEC活化过程中起重要作用;CD40-CD154相互作用并通过NF-κB通路诱导VEC活化;NF-κB通路阻断剂可抑制VEC活化.     

肝癌细胞上清液对树突状细胞的抑制作用与NF-κB通路有关

目的　研究肝癌细胞上清液对树突状细胞 (DC)的抑制作用及其机制。方法　将肿瘤上清液与树突状细胞共培养 ,于DC培养的当天加入 2 0 %体积的肝癌细胞上清液或等体积完全培养液 ,于更换培养液的同时亦半量更换肿瘤上清液。在培养的第 5天 ,收集加入等体积培养液R10的正常成熟DC(简称DC)和加入肝癌细胞上清液培养的DC(DC SN)。流式细胞仪检测其免疫表型、混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞增殖能力、胶漂移实验检测NF κB表达。结果　加入肝癌细胞上清液培养的DC ,与正常成熟的DC比较 ,MHCI类分子阳性率由 74 8%降为 5 9 2 %、MHCII类分子阳性率由 72 5 %降为 2 5 7%、CD80和CD86分子阳性率分别由 4 6 6 %和 36 7%降至 14 1%。其刺激T细胞增殖的能力亦明显下降 ,当刺激细胞∶反应细胞为 1∶80、1∶4 0、1∶2 0、1∶10时 ,DC组的3 H TdR掺入率分别为 8 0× 10 3 、12 0× 10 3 、14 8× 10 3 、18 2× 10 3 ,明显高于DC SN组的 0 9× 10 3 、0 6× 10 3 、0 6×10 3 、0 6× 10 3 。胶漂移反应见加入肝癌细胞上清液培养的DC中的NF κB表达条带缺失。结论　肝癌细胞上清液可以抑制DC的最终成熟 ,导致其T细胞刺激能力下降 ,其机制可能与NF κB信号传导通路受抑制有关。     

NF-κB通路在单核细胞诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察单核细胞（U937细胞）对人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）转分化的影响及其分子机制。 方法 将HK-2细胞与人单核细胞系U937细胞共培养;倒置相差显微镜观察HK-2细胞形态;Western印迹、实时荧光定量PCR法检测α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤连蛋白（FN）、E钙黏蛋白（E-cadherin）和胞间黏附分子1（ICAM-1）表达;BCECF-AM荧光染色法测定单核细胞黏附;流式细胞仪法检测HK-2细胞表面分子ICAM-1表达;基因芯片筛选HK-2细胞基因变化;利用信号阻断剂阻断基因芯片筛选出的信号通路,进一步验证单核细胞诱导肾小管上皮细胞转分化的分子机制。 结果 单核细胞可直接诱导HK-2细胞发生形态变化,减少HK-2细胞E-cadherin表达（均P < 0.05）,并上调α-SMA、FN表达（均P < 0.05）。应用CD18抗体阻断CD18-ICAM-1可抑制单核细胞黏附及其诱导的HK-2细胞形态变化。基因芯片结果显示,NF-κB信号通路分子CC亚族趋化因子配体20（CCL20）、白细胞介素（IL）2、IL-8、脂磷壁酸（LTA）及血小板内皮细胞黏附分子1（PECAM1）表达明显增加（均P < 0.05）。NF-κB信号阻断剂吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）能显著抑制HK-2细胞形态变化及表面ICAM-1表达,抑制单核细胞诱导的肾小管上皮细胞转分化。 结论 单核细胞通过CD18分子与HK-2细胞表面ICAM-1结合,从而启动NF-κB信号通路介导的特定基因转录,最终导致肾小管上皮细胞发生转分化。     

成骨诱导后的骨髓间充质干细胞对外周血单个核细胞增殖的免疫调节作用

目的:探索骨髓间充质干细胞(BMSCs)及成骨诱导后的骨髓间充质干细胞(OM-BMSCs)对同种异体的外周血单个核细胞(PBMCs)的免疫调节作用。方法:分离比格犬BMSCs,成骨诱导培养基(ost eogenic medium,OM)进行成骨诱导,建立BMSCs、OM-BMSCs与同种异体PBMCs的共培养体系,分三种实验条件,共9组。A组:5×104受体PBMCs加入5×104供体PBMCs共培养;B组:A组组分加入已铺被1×104/孔BMSCs的96孔板;C组:A组组分加入已铺被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板;D组:5×104受体PBMCs加入植物血凝素A(PHA)刺激物;E组、F组:将D组组分按B、C组方式处理;G组:5×104受体PBMCs加入IL-2炎症因子;H组、I组:G组组分按B、C组方式处理。A、D、G组分别为三个实验条件的对照组,单独接种1×104/孔BMSCs、OM-BMSCs作为空白对照组Bl ank1组、Bl ank2组。以上各组分别培养120h后,应用Cell Titer 96 Aqueous检测各组PBMCs的增殖情况。结果:在各实验条件下与相应对照组相比较,BMSCs与OM-BMSCs均能抑制双向混合淋巴细胞反应(MLR)中PBMCs的增殖,均能抑制经PHA刺激后PBMCs的增殖,均能抑制经IL-2刺激后PBMCs的增殖(P<0.01)。结论:BMSCs及成骨分化的BMSCs对刺激细胞、PHA、IL-2刺激的同种异体PBMSs的增殖均表现为抑制效应,成骨分化后的骨髓间充质干细胞对同种异体免疫反应仍具有免疫调节作用。     

白细胞介素-10选择性抑制钛颗粒激活的巨噬细胞活性研究

目的　本实验研究钛颗粒通过特定的信号传递通道激活巨噬细胞的转录因子核因子 IL 6(NF IL 6)、核因子 κB(NF κB)的表达 ,检测白细胞介素 (IL) 1β、 6和肿瘤坏死因子 (TNF) α水平 ,并采用细胞因子抑制剂IL 10处理巨噬细胞 ,观察其对巨噬细胞活性的抑制作用。方法　从健康人外周静脉血中分离单核 /巨噬细胞 ,进行体外培养。巨噬细胞处理用钛颗粒浓度为 0 .0 75 %(体积比 )。IL 10组先用IL 10 (2 0 μg/L)预处理巨噬细胞 10min ,后再加入钛颗粒。按不同时间段采集细胞培养液和巨噬细胞。培养液中细胞因子IL 6、IL 1β和TNF α采用ELISA方法检测。巨噬细胞经核酸抽提 ,采用EMSA方法检测NF IL 6和NF κB ,并经半定量分析。结果　未经钛颗粒刺激的巨噬细胞 ,48h内上清液中未能检测出上述细胞因子。钛颗粒刺激后 2h ,上清液中检测出IL 6,4h后可检测出IL 1β和TNF α。TNF α在 12h达到高峰 ,IL 6和IL 1β在 2 4h达到高峰 ,随后下降。IL 10在各时相抑制近一半IL 6的释放 (P <0 .0 5 ) ;IL 1β和TNF α也受到IL 10不同程度的抑制 ,但是差异并无显著性 (P >0 .0 5 )。经钛颗粒刺激后 1h ,EMSA方法即可检测出NF IL 6表达 ,并持续表达 5h。IL 10预处理的巨噬细胞 ,NF IL 6的表达量减少 (P <0 .0 5 )。巨噬细     

内毒素诱导共培养中性粒细胞——血管内皮细胞活化的体外研究

目的　建立人外周血中性粒细胞与人脐静脉血管内皮细胞系ECV 30 4体外共培养模型 ,研究内毒素对共培养中性粒细胞 血管内皮细胞活化的作用。　方法　将ECV 30 4细胞接种培养 ,待细胞接近融合 ,加入 2× 10 6/ml即时分离纯化的人外周血中性粒细胞 ,按不同的分组加入不同浓度的内毒素 (lipopolysaccharide ,LPS) ,在倒置显微镜下观察细胞形态学的改变 ,于 4、8、12、2 4h测定细胞上清中TNFα及IL 6水平的变化。　结果　不同浓度的LPS刺激内皮细胞TNFα产生没有明显的变化 ,而 1μg/mlLPS刺激共培养中性粒细胞 -ECV 30 4 ,在 4h其TNFα水平明显上升 ,10 μg/mlLPS刺激共培养中性粒细胞 -ECV 30 4 ,其TNFα水平逐渐上升 ,8h后比较明显 (P <0 .0 5 ) ,12、2 4h仍维持较高水平 ;对于单纯内毒素刺激ECV 30 4细胞 ,随着LPS浓度的增加 ,IL 6生成明显增加。 1μg/mlLPS刺激ECV 30 4IL 6自 4h后即明显上升 ,8、12h一直维持在高水平 ,直到 2 4h才明显回落。对于共培养的中性粒细胞和血管内皮细胞 ,单纯共培养中性粒细胞 -ECV 30 4IL 6无明显变化 ,而较低浓度10 0ng/mlLPS刺激共培养中性粒细胞 -ECV 30 4IL 6与 1μg/mlLPS刺激ECV 30 4相当 ,2 4h仍维持在高水平。 1μg/ml及 10 μg/ml刺激共培养中性粒细胞 -ECV 30     

恶性骨肿瘤来源成纤维母细胞促进溶骨作用

[目的]检验恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞是否能够支持破骨细胞分化及其溶骨作用。[方法]酶消化法从肿瘤组织中分离成纤维母细胞并作体外培养。细胞传代后，一部分成纤维母细胞与外周血单核细胞共培养，分别加入M-CSF、骨保护素（OPG）及抗TNFα中和抗体。同时，作者还应用了Transwell系统检验可溶性促溶骨性因子的表达。培养结束后检测抗酒石酸磷酸酶（TRAP）的表达及骨吸收陷窝的形成，并比较各组细胞的骨吸收活性。另一部分成纤维母细胞单独培养，RT-PCR法检测其细胞核因子KB受体活化因子配体（RANKL）和TNFα mRNA的表达。[结果]在M-CSP存在的条件下，2种细胞共培养组分别于14、21d观察到TRAP阳性的多核细胞和骨吸收陷窝形成；大剂量OPG彻底阻断TRAP阳性多核细胞及骨吸收陷窝的形成，而大剂量抗TNFa中和抗体对成纤维母细胞支持的破骨细胞形成未显示抑制作用。RT-PCR结果显示恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞能够表达RANKL和TNF-α mRNA。[结论]在M-CSF存在的条件下，恶性骨肿瘤来源的成纤维母细胞通过表达RANKL支持破骨细胞分化及其溶骨作用。     

红细胞对血液透析患者单个核细胞分泌功能的影响

目的　探讨红细胞 (RBC)与尿毒症病人单个核细胞分泌功能之间的关系。方法　采用细胞培养技术 ,观察正常人RBC、病人自体RBC、绵羊RBC、红细胞膜碎片、鼠抗人淋巴细胞CD2单克隆抗体 (CD2McAb)对血液透析 (血透 )病人单个核细胞 (PBMNC)分泌白细胞介素 2 (IL 2 )、单核细胞(PBMC)分泌肿瘤坏死因子 (TNF)的影响。结果　自体RBC、同种异体RBC以及绵羊RBC、CD2McAb对病人PBMNC、PBMC分泌IL 2、TNF均有增强作用。自体RBC与CD2McAb共同对PBMNC、PBMC分泌IL 2、TNF有促进作用 ,但与单独加入自体RBC或CD2McAb时相比无显著差异。各种红细胞膜碎片、CD4McAb、CD8McAb、小鼠IgG对PBMNC、PBMC分泌IL 2、TNF无影响。结论　RBC对PBMNC、PBMC分泌IL 2、TNF有直接促进作用 ,其机制认为是通过红细胞表面LFA 3与单个核细胞表面CD2受体之间的相互作用所致。     

IL-4与IL-10联合诱导异种骨移植免疫耐受的体外研究

目的　探讨 IL - 4和 IL - 10在诱导异种骨移植免疫耐受中的作用。方法　反应细胞为 BAL B/c小鼠脾淋巴细胞 ,刺激细胞为新西兰白兔血淋巴细胞 ,刺激抗原为兔骨上清液。采用经典的混合淋巴细胞培养法及骨上清液与淋巴细胞混合培养法作为异种骨移植的体外实验模型。在各培养液中分别加入 IL - 4、IL - 10及两者联合应用 ,通过测定其 3H- Td R掺入率 ,观察不同细胞因子对刺激淋巴细胞增殖的影响。结果　无论在细胞刺激组还是骨上清液刺激组 ,IL- 4对淋巴细胞增殖均有显著抑制作用 (P<0 .0 0 1和 P<0 .0 5 ) ,IL- 10未表现出抑制作用 (P>0 .0 5 )。在两组 IL- 4和 IL - 10联合应用均产生比 IL - 4单独应用更为明显的细胞增殖抑制作用 (P<0 .0 0 1和 P<0 .0 5 )。结论　 IL - 4对由细胞或骨上清液刺激产生的淋巴细胞增殖均有很好的抑制作用 ,IL- 10没有表现出抑制作用 ;IL- 4与 IL- 10联合应用有协同抑制作用。     

T淋巴细胞共刺激分子调节单核细胞与内皮细胞相互作用中CD80表达的研究

目的 研究CD4+T淋巴细胞在调节单核细胞与血管内皮细胞相互作用中CDS0的表达水平及其意义.方法 建立单核细胞一血管内皮细胞(EC)共培养和单核细胞-CD4+T淋巴细胞-EC共培养体系,于培养72 h时收集细胞.采用流式细胞术(FACS)检测CD80在CD14+单核细胞表面的表达;通过实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测CDS0基因转录的表达变化.建立含有或不含抗CD86、CD28和CD154单克隆抗体的单核白细胞(PBMC)-EC混合培养体系,通过FACS检测CD14+单核细胞表面CDSO的表达,采用混合淋巴细胞-EC反应(MLER)来研究CD54和CD28封闭在抑制淋巴细胞对同种异体EC增殖中的作用.结果 经FACS分析确定,无论是活化还是未活化的EC膜均缺乏CD80、CD86和CD14的表达.RT-PCR表明在缺乏CD4+T淋巴细胞时,经同种EC刺激的单核细胞可上调CD80基因转录水平的表达.但这些CD14+单核细胞膜表面CD80的表达并未上调,当CD4+T淋巴细胞加入到共培养中时,CD80的表达上调.用抗CD28和抗CD86抗体封闭CD28和0986并不能阻止CD14+单核细胞表面CDSO表达的上调.此外,阻断CD154也不能下调CD80的高表达.MLER证明淋巴细胞对EC的增殖反应可部分的被抗CD28和抗CD154抗体所阻断;阻断CD80可抑制经EC刺激的单核细胞诱导T淋巴细胞增殖反应.结论 在缺乏T淋巴细胞的条件下,经同种EC刺激的单核细胞可在基因转录水平上调CD80,而不是在其细胞膜表面的表达.当T淋巴细胞存在时,经EC刺激的CD14+单核细胞可在其膜表面上调CD80的表达.CD14+单核细胞膜表面CD80表达的上调并不能被CD154和CD28封闭所阻止,显示其上调是通过CD154和CD86非依赖性通道.     

新一代多克隆抗体抑制异种细胞免疫反应的研究

目的 研究新一代兔抗人免疫细胞多克隆抗体(newRALG)对异种细胞免疫反应的抑制作用.方法 应用活化的淋巴细胞和单核细胞致敏新西兰兔后获得newRALG.将PKH-26标记的猪血管内皮细胞(PEC)和正常人单个核细胞(PBMC)建立混合培养体系,培养液中分别加入newRALG、正常兔IgG、Thymoglobulin和Scavenger受体(SR)阻断剂Poly G,培养后收集PBMC,然后分别加入异硫氰基荧光素(FITC)标记的鼠抗人CD14、CD40、CD80、CD86和HLA-DR单克隆抗体.通过流式细胞术检测单核细胞对PEC膜的吞噬作用;通过淋巴细胞与PEC的混合培养体系,加入newRALG,以观察淋巴细胞的增殖反应和newRALG对增殖反应的阻断作用.结果 PBMC与PKH-26标记的PEC共培养后,PBMC中的CD86+单核细胞表达PKH-26,进一步研究发现PKH-26阳性的CD86+单核细胞不但表达CD14、CD86和HLA-DR,同时上调共刺激分子CD40和CD80的表达水平.正常兔IgG(作为阴性对照)对单核细胞吞噬PEC膜无阻断作用,Thymoglobulin具有较低的阻断效果,newRALG与Poly G相似,均具有较高的阻断作用.正常未经刺激的人淋巴细胞不具备增殖能力,经灭活的PEC刺激后,人淋巴细胞具有高水平的免疫增殖反应.正常兔IgG不能阻断PEC对人淋巴细胞的免疫增殖反应;Thymoglobulin的抑制作用随浓度的降低而增强;高浓度的newRALG不能抑制人淋巴细胞的免疫增殖反应,但低浓度的newRALG则显示出强大地抑制人淋巴细胞免疫增殖反应的作用.结论 单核细胞在异种免疫反应过程中发挥重要作用;newRALG可有效抑制单核细胞的吞噬功能和淋巴细胞的免疫增殖反应,从而有效的抑制异种移植排斥反应.     

蒽环类抗肿瘤药物的免疫激活作用及其机制

目的探讨蒽环类药物除了损伤细胞DNA杀伤肿瘤细胞外, 是否具有诱导肿瘤细胞免疫原性死亡激活抗肿瘤免疫反应。方法采用THP1-Dual单核细胞中干扰素刺激基因(ISG)的报告系统, 检测蒽环类药物伊达比星、柔红霉素和阿霉素对ISG的影响, 并采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)的方法检测蒽环类对干扰素(IFNB、IFNA4)和趋化因子IP-10的基因表达影响, 以及检测伊达比星对多种肿瘤细胞IFNB的表达影响。采用蛋白免疫印迹的方法, 检测蒽环类化合物对干扰素上游TBK1/IRF3信号通路的影响。最后, 采用ATM抑制剂和TBK1抑制剂和STING敲除的THP1-Dual报告细胞, 分析伊达比星是否通过DNA损伤感受通路刺激IFNB的生成。采用单因素方差分析。结果蒽环类药物具有促进ISG的表达及干扰素基因(IFNB)生成的作用, 其中伊达比星的效果最强, 在1 μmol/L下作用24 h后对ISG激活约5倍(P<0.01), 在1 μmol/L下作用6 h后对IFNB、IP-10和IFNA4基因激活分别达21.4、3827.2、4.3倍(P<0.01)。在多种肿瘤细胞株中, 伊...     

脂多糖诱导外周血嗜酸粒细胞释放炎性细胞因子的探讨

目的：探讨脂多糖（LPS）对嗜酸粒细胞释放炎性细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响。方法：嗜酸粒细胞用CD16抗体磁珠方法从人新鲜外周血中分离;分别进行5×10^5／ml嗜酸粒细胞的单独培养和与LPS（1ug／ml）共培养18h;应用流式细胞小球微阵列（cytometric bead array,CBA）方法定量测定细胞培养上清液中细胞因子含量。结果：从外周血中新分离的嗜酸粒细胞单独培养过程中没有或仅有极少量上述炎性细胞因子释放,但新分离的嗜酸性粒细胞与LPS共培养18h后,其培养上清液中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α大量增加（P均〈0．001）,而IL-2、IL-4、IL,12和IFN-γ的含量无明显变化。结论：LPS对嗜酸粒细胞释放炎性细胞因子具有很强的选择性诱导作用。     

氧化低密度脂蛋白对巨噬细胞的作用及机制

目的 观察氧化低密度脂蛋白(oxLDL)对巨噬细胞增殖和分泌巨噬细胞迁移抑制因子(MMIF/MIF)的作用.方法 (1)制备人单核细胞来源巨噬细胞(MDMs),25、50和75 mg/L浓度oxLDL培养12、24、48 h后,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖,酶联免疫吸附法测定上清MIF浓度;不含oxLDL培养为正常对照(NC)组.(2)制备含稳转核因子-κB (NF-κB)-LUC质粒的MDMs,同法培养,荧光素酶底物(Luciferase)检测细胞NF-κB通路活性.(3)含NF-κB-LUC质粒的MDMs中加入终质量浓度为0、10 μmol/L的NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082,同法培养并检测上清MIF浓度.结果 (1)与NC组比较,25、50、75 mg/L oxLDL组12 h时MDMs增殖显著升高,48 h时分别达到17.7％、27.8％和41.2％ (P ＜0.01);其上清液MIF也在12h起升高,48 h时分别是NC组的1.49、1.67和2.09倍(P＜0.01).(2)与NC组比较,oxLDL各组在12h即可检测到NF-κB通路明显激活,24h时MDMs内NF-κB通路活性分别增加38.1％、60.3％和61.1％ (P＜0.01).(3)加入BAY11-7082后,各组上清液MIF浓度在12 h即出现明显下降,48 h时分别下降58.6％、69.3％、69.7％和73.5％ (P＜0.01).结论 25 ～ 75 mg/L浓度的oxLDL可促进MDMs增殖和MIF的分泌,其作用随oxLDL作用时间的延长和浓度的增高而增强.oxLDL可能通过诱导激活NF-κB信号通路促进MDMs合成分泌MIF.     

CTLA4-Ig和IL-4诱导异种骨移植免疫耐受的体外研究

目的探讨CTLA4Ig和IL4在诱导异种骨移植免疫耐受中的作用。方法反应细胞为BALB/c小鼠脾淋巴细胞,刺激细胞为新西兰白兔血淋巴细胞,刺激抗原为兔骨上清液。采用经典的混合淋巴细胞培养法及骨上清液与淋巴细胞混合培养法作为异种骨移植的体外实验模型。在各培养液中分别加入CTLA4Ig、IL4及两者联合应用,通过测定其3HTdR掺入率,观察不同细胞因子对刺激淋巴细胞增殖的影响。结果1细胞刺激组CTLA4Ig和IL4均对淋巴细胞增殖有显著抑制作用P<0.001),CTLA4Ig与IL4联合应用并未显示出比CTLA4Ig单独应用更为明显的细胞增殖抑制作用(P>0.05)。2骨上清液刺激组:CTLA4Ig对细胞增殖无抑制作用(P>0.05),而IL4则有较为显著地细胞增殖抑制作用(P<0.05);CTLA4Ig与IL4联合应用也未产生比单独应用IL4更为明显的细胞增殖抑制作用(P>0.05)。结论CTLA4Ig对由细胞刺激产生的淋巴细胞增殖抑制效果较好,而IL4则对骨上清液刺激的细胞增殖抑制作用更好;CTLA4Ig与IL4联合应用并未产生协同抑制作用。     

骨碎补通过骨髓间充质干细胞调节RANKL/OPG抑制破骨细胞的实验研究

目的　研究骨碎补对绝经后骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)RANKL/OPG及破骨细胞分化成熟的影响并探查其可能的作用机制。方法 实验大鼠去双侧卵巢造模,分为实验组（OVXDF,造模+骨碎补水煎液灌胃）、模型组（OVX,造模+0.9%生理盐水灌胃）、假手术组（SHAM,假手术+0.9%生理盐水灌胃）,造模成功后提取BMSCs,将BMSCs和骨髓单核细胞共培养于Transwell小室的上室和下室,分为实验组+破骨细胞（OVXDF+OC）、模型组+破骨细胞（OVX+OC）、假手术组+破骨细胞（SHAM+OC）。下室加入破骨细胞诱导剂,倒置相差显微镜观察破骨细胞的分化成熟情况并计数,酶联免疫吸附剂测定（ELISA）检测下室培养液中骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、RANKL的含量,并计算RANKL/OPG,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法(Western blot)检测BMSCs中Wnt10b、β-catenin、RANKL、OPG mRAN及蛋白表达并计算RANKL/OPG。结果 在共培养系统中,与去卵巢灌胃大鼠BMSCs共培养的破骨细胞（OVXDF+OC）数量较单纯模型组+破骨细胞（OVX+OC）明显减少（P＜0.05）。下室培养液OPG含量及共培养BMSCs中Wnt10b、β-catenin、OPG mRAN及蛋白表达模型组+破骨细胞（OVX+OC）最低,RANKL及RANKL/OPG最高,经骨碎补灌胃后（OVXDF+OC）培养液中OPG含量及BMSCs细胞中Wnt10b、β-catenin、OPG mRAN及蛋白表达明显升高,培养液及BMSCs细胞中RANKL及RANKL/OPG明显降低（P＜0.05）。结论 骨碎补可调节BMSCs细胞OPG、RANKL的表达,激活OPG/RANKL/RANK信号通路抑制破骨细胞的分化和成熟,此作用可能与BMSCs的Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

骨髓间充质干细胞诱导同种异体B细胞向CD5~＋调节性B细胞转化体外实验

目的研究骨髓间充质干细胞（BMSC）诱导高分泌IL-10的调节性B细胞（Breg）的产生及机制。方法采用成功分离的DA大鼠BMSC与Wistar大鼠B细胞共培养（BMSC＋B）96h后,ELISA检测BMSC＋B组细胞培养上清中IL-10的浓度和分泌细胞因子的变化,设单纯BMSC、单纯B细胞两组对照;流式细胞术分析B细胞表型的变化;通过加入中和抗体,观察细胞因子对BMSC诱导Breg细胞产生的影响。结果 BMSC＋B组成功诱导产生高分泌IL-10的Breg细胞（P=0.006）;Breg表型为CD19＋CD1d＋CD5＋;IFN-β促进BMSC诱导Breg的产生（P=0.034）。结论 BMSC能诱导高分泌IL-10的CD5＋Breg产生,该机制可能与BMSC自身分泌的IFN-β有关     

Intermedin拮抗血管紧张素Ⅱ诱导系膜细胞增殖的作用及其机制

目的 观察Intermedin (IMD)对血管紧张素Ⅱ(angiotensionⅡ,AngⅡ)诱导的人肾小球系膜细胞(human mesangial cells,HMCs)增殖的影响及其机制.方法 将人肾小球系膜细胞分为5组:A组(对照组):培养液中不加任何刺激物;B组(AngⅡ组):10-6 moI/L AngⅡ;C组(IMD组):10-6 moI/L AngⅡ+10-7 mol/L IMD;D组(PKA抑制剂组):10-6 moI/L AngⅡ+10-6 mol/L PKA抑制剂H-89+ 10-7 mol/LIMD;E组(氯沙坦组):10-6mol/L AngⅡ+10-6mol/L氯沙坦.MTT法检测个组HMCs增殖情况;比色法检测羟脯氨酸含量;ELISA试剂盒测量各组细胞上清液中的TGF-β1、cAMP、ERK的表达.结果 与AngⅡ组相比,IMD可明显抑制AngⅡ诱导的肾小球系膜细胞的增殖及上清液中转化生长因子(TGF-β1)及羟脯氨酸(Hyp)的表达(P＜0.001),加入PKA抑制剂后IMD上述作用被抑制(P＜0.001).与对照组相比,AngⅡ组可明显增加cAMP的含量并抑制ERK的表达,在加入IMD后上述作用被抑制(P＜0.001).结论 IMD可明显抑制AngⅡ诱导的肾小球系膜细胞的增殖,其机制可能与其促使cAMP第二信使水平的升高并抑制细胞中的ERK信号通路有关.     

可诱导共刺激分子与人IgG Fc融合蛋白诱导同种免疫低应答的体内外实验

目的 探讨真核表达人可诱导共刺激分子(ICOS)与人IgG Fc融合蛋白(ICOS-Ig融合蛋白)在体内外对同种免疫应答的影响.方法 构建ICOS-Ig融合蛋白表达载体,在CHO细胞中表达并纯化ICXIS-Ig融合蛋白.以Balb/c小鼠脾细胞为反应细胞,经Co60照射灭活的(257BL/6小鼠脾细胞为刺激细胞,进行初次混合淋巴细胞反应(MLR),MLR体系中分别加入50μ,/ml IOOS-Ig融合蛋白(ICOS-Ig组)或对照IgG(IgG组),采用氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法检测反应细胞的增殖情况,酶联免疫吸附试验(ELSA)检测培养上清液中自细胞介素(IL)2、4、10以及γ干扰素(IFN-γ)的含量.收集初次MLR细胞,与灭活的C57BL/6小鼠脾细胞或C3H小鼠脾细胞共培养,进行再次MLR,检测指标同初次MLR.以Co60照射Balb/c小鼠,经尾静脉输注用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记的C57BL/6小鼠脾细胞,每天腹腔注射ICOS-Ig融合蛋白0.2 mg(IOOS-Ig组)、IgG(对照IgG组)或环孢素A(CsA组),3 d后取Balb/c小鼠脾细胞,流式细胞仪测定CFSE荧光强度以判断同种T淋巴细胞的体内增殖情况.结果 初次MLR显示,ICOS-Ig组同种T淋巴细胞活化增殖的抑制率为(58±8)%,其培养上清液中IFN-γ的水平明显高于IgG组(P<0.05).再次MLR显示,IOOS-Ig融合蛋白能特异性抑制C57BL/6小鼠脾细胞所致的细胞增殖,抑制率为(42±8)%,IL-4和Ⅱ-10的分泌受到抑制,而IFN-γ7的分泌增加;ICOS-Ig融合蛋白并不抑制第三方细胞所致的细胞增殖.体内实验显示,ICOS-Ig组和CsA组的CFSE荧光强度明显强于空白对照组和对照IgG组(P<0.05),而联合处理组CFSE荧光强度强于ICOS-Ig组和CsA组(P<0.05).结论 ICOS-Ig融合蛋白在体内外均可抑制同种T淋巴细胞的活化增殖,且这种作用具有特异性.     

OX-LDL诱导活化的巨噬细胞对肾小球系膜细胞TGF-β与Fn基因表达的影响及水蛭素的干预作用

目的：研究氧化低密度脂蛋白（OX—LDL）诱导活化的巨噬细胞对肾小球系膜细胞转化生长因子（TGF-β）、纤连蛋白（Fn）基因表达的影响以及水蛭素的干预作用，探讨炎症状态下肾硬化发生的病理机制和水蛭素的有效作用。方法：体外培养大鼠肾小球系膜细胞，将OX—LDL诱导活化的大鼠腹腔巨噬细胞转入细胞培养小室，或采集其条件培养基与肾小球系膜细胞共培养；水蛭素干预组在分层共培养系统的培养有系膜细胞的下层培养液中加入水蛭素。浓度分别为2.5U／ml、5．0U／ml、10U/ml。逆转录-聚合酶链扩增反应（RT—PCR）检测肾小球系膜细胞TGF-β、Fn的基因表达。结果：OX—LDL刺激后，大鼠腹腔巨噬细胞上清液中IL-1浓度明显升高；无论是活化的巨噬细胞还是其奈件培养基均能上调TGF-β和Fn mRNA的表达，但以分层共培养作用最为显著；水蛭素在一定浓度下可显著下调T（再一p和Fn的基因表达。结论：（1）在分层共培养条件下，OX—LDL诱导活化的巨噬细胞与系膜细胞处于一个整体系统中，巨噬细胞不仅可通过分泌细胞因子等病理产物，而且两种细胞还可能通过相互作用增强对系膜细胞增殖和TGF-β和Fn分泌等的促进作用。（2）水蛭素可能通过抑制病理条件下硬化因子和细胞外基质的基因表达起到干预肾硬化的作用。