布鲁菌104M∶Omp19过表达株的构建与免疫保护性评价

目的:利用表达载体p NSGro E2His构建104M∶Omp19过表达株,以增强现有布鲁菌疫苗104M株免疫保护效果。方法:以布鲁菌疫苗104M株基因组为模板,通过PCR扩增得到Omp19基因;将经过Bam HⅠ和XbaⅠ双酶切的Omp19基因连接到经同样双酶切处理的p NSGro E2His载体上,构建Omp19-p NSGro E2His过表达质粒;将构建的过表达质粒转化布鲁菌104M株感受态细胞,利用氯霉素抗性筛选构建成功的104M∶Omp19过表达株;通过皮下免疫BALB/c小鼠,从激发的抗体水平、细胞因子水平以及对抗布鲁菌A19株攻毒后的保护作用等方面评价104M∶Omp19过表达株的免疫保护效力。结果:PCR及Western印迹验证表明获得了104M∶Omp19过表达突变株;免疫评价实验显示104M∶Omp19在抗体水平、细胞因子水平与攻毒保护性方面均优于104M,低剂量免疫即可达到较好的保护效果。结论:布鲁菌疫苗104M株过表达Omp19抗原后,免疫保护效果显著增强,可作为一种新的布鲁菌疫苗候选菌株进行后续研究。     

布鲁菌抗体检测试剂盒稳定性的研究

目的评估布鲁菌抗体检测试剂盒(试管凝集法)的质量稳定性,在产品注册时提交模拟运输条件相关研究资料,即由2～8℃冷链运输条件变更为常温2～30℃(不超过6 d)运输。方法用连续3批次布鲁菌抗体检测试剂盒(试管凝集法)试剂,对其进行模拟运输条件试验,同时进行热加速稳定性、开瓶稳定性以及实时稳定性试验,通过观察外观、阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、最低检出量和均一性,考察其试剂盒的稳定性。结果模拟运输试验结果显示,布鲁菌抗体检测试剂盒(试管凝集法)在模拟运输2～30℃不超过8 d时,其外观、阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、最低检出量及均一性均符合《中华人民共和国药典》2015年版(三部)的检定标准,试剂盒质量稳定。热加速稳定性结果显示,在36～38℃放置不超过6 d时质量稳定;开瓶稳定性结果显示,开瓶后12周内质量稳定。连续3批次试剂实时稳定性在试剂盒效期后一个月检测结果仍合格。结论布鲁菌抗体检测试剂盒(试管凝集法)具有良好的稳定性,运输条件由2～8℃冷链运输可变为2～30℃不超过6 d的常温运输;在2～8℃试剂盒可保存12个月,开瓶后在12周内质量稳定,产品于2018年1月份在国家药品监督管理局完成注册,运输条件的变更获得批准。     

per基因突变对布鲁菌稳定性的影响

目的:构建过骨胺酸合成酶基因(per)敲除的布鲁菌,研究per基因对布鲁菌株稳定性的影响。方法:构建p MD19-T:kan敲除载体,电击转化至流产布鲁菌,体内同源重组敲除per基因,分析per基因敲除对布鲁菌遗传特征和稳定性的影响。结果:构建了per基因敲除的流产布鲁菌株,per缺失突变布鲁菌连续传代培养后,测序分析未发现回复突变,品红及硫堇培养鉴定符合布鲁菌特征。结论:布鲁菌基因组per基因的缺失突变不影响布鲁菌的遗传稳定性,为研制布鲁菌per基因减毒突变疫苗提供了依据。     

牛布鲁菌S19噬菌体裂解物主动免疫诱导的血清IgG保护豚鼠并可被动免疫保护小鼠

正布鲁菌病是全球范围内一种对经济有重大影响的人畜共患病。作者2015年曾报道过使用布鲁菌噬菌体"ΦLd"制备抗牛布鲁菌S19的噬菌体裂解物的方法。此项研究中,在使用裂解物固定剂量(两倍小鼠100%的保护剂量)的情况下,用豚鼠直接攻毒和小鼠被动保护试验(PMPT)评估了不含佐剂和以铝凝胶为佐剂的两种裂解物的预防功效。与S19疫苗相比,低剂量(1.0μg蛋白质和120μg碳水化     

自身免疫性肝炎合并慢性布鲁菌病1例并文献复习

目的探讨自身免疫性肝炎合并布鲁菌感染时的临床特征、诊断及其治疗等特点。方法回顾性分析我院确诊的1例自身免疫性肝炎合并慢性布鲁菌感染患者的临床特点、相关指标的检测结果并结合文献报道进行总结。结果患者临床表现缺乏特异性。血培养和血清抗体检测呈阳性,C-反应蛋白(CRP)可见升高而降钙素原(PCT)变化不明显。结论布鲁菌病不能仅从临床表现来鉴别和诊断,更不能因为缺少流行病学资料而否定。自身免疫性肝炎患者的CRP水平对急性炎症的敏感性会降低,但仍可以作为疗效判断的参考指标。应适度增加疗程,定期复查,以更好的控制慢性布鲁菌感染。     

布鲁菌病的生物安全及防控

布鲁菌病(brucellosis)是布鲁菌入侵机体引起的传染-变态反应性人兽共患传染病,易被忽视。该病严重威胁人类健康,影响畜牧业、旅游业的发展,阻碍正常国际贸易,还会造成食品安全隐患。布鲁菌可通过消化道、呼吸道及皮肤黏膜破损处等途径传播至人。人群对布鲁菌的易感性无年龄和性别差异,可通过直接或间接接触感染。从事布鲁氏菌研究的实验室操作人员有发生实验室获得性感染的风险,但可通过有效的生物安全防护措施避免感染的发生。布鲁菌病是一种可防可控的疾病,必须早期诊断和正确治疗,防止疾病慢性化。本文对布鲁菌病的生物安全及其防控原则进行介绍。     

布鲁菌毒力因子研究进展

布鲁菌是一种兼性细胞内寄生菌,能够严重地导致人畜共患布鲁菌病。本文就影响布鲁菌致病能力的毒力因子进行综述。     

布鲁菌噬菌体的生物学特性研究进展

布鲁菌属(Brucellae)细菌在核酸水平上非常相似,随着不同环境中布鲁菌新种及变异菌的出现,噬菌体分型实验在布鲁菌种的分型鉴定中依然发挥着不可替代的作用,本文从布鲁菌噬菌体的生长特征和宿主范围方面进行综述。     

不同种型布鲁菌间的基因获得与缺失研究

目的:了解不同种型布鲁菌间的基因差异及基因的获得与缺失情况。方法:采用生物信息学方法比较分析已测序的10株布鲁菌基因水平的差异,分析它们的核心基因组与泛基因组,对得到的差异基因用PCR验证其在19株不同生物型标准菌株中的分布情况。结果:不同种型布鲁菌在基因水平上存在较大差异,差异基因主要位于Ⅱ号染色体上;根据差异基因,鉴定了42个差异区段,这些差异区段在19株不同生物型标准菌株中存在差异分布。结论:布鲁菌在进化过程中分别获得或失去了不同的基因区段,从而适应不同的宿主环境。     

一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性质粒的构建及应用

[背景]布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的一种人兽共患传染病,对畜牧业发展和人类健康有着巨大的威胁。利用新型报告基因NanoLuc荧光素酶构建一种可以检测布鲁菌基因启动子活性的质粒,对于研究布鲁菌毒力基因的调控表达具有重要意义。[目的]制备NanoLuc荧光素酶多克隆抗体,构建一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并通过测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性验证该方法的可行性。[方法]构建NanoLuc荧光素酶原核表达载体pET-Nluc,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;以广宿主质粒pBBR1MCS为骨架,构建质粒pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc,通过电转化构建S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株,在体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性;比较分析virB启动子在胞内感染条件下和体外培养条件下的活性。[结果]通过原核表达获得NanoLuc荧光素酶重组蛋白,并制备得到效价高于1:100 000的多克隆抗体;成功构建pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc质粒以及S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株;体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性,结果显示pNluc质粒可以精确报告其活性;测定virB启动子在胞内诱导条件下和体外培养条件下的活性,结果显示virB启动子活性在胞内感染条件下明显增强。[结论]构建了基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并验证其可以精确反映布鲁菌基因启动子活性,为研究布鲁菌毒力基因以及揭示其致病机制奠定了基础。     

布鲁菌抗原的快速克隆与高效表达

目的:通过Gateway技术构建布鲁菌抗原表达载体,并筛选出高效可溶性表达载体。方法:以山羊布鲁菌16M株染色体DNA为模板,扩增4个布鲁菌抗原基因BMEI2002、BMEI1069、BMEI1483和BMEI0748,利用GatewayBP反应将基因克隆到入门载体pDONR201中,构建重组质粒,然后用Gateway LR反应将基因重组到3种表达载体(pDEST17、pHXGWA、pHGGWA)中,构建相应的重组表达质粒,将重组质粒转化大肠杆菌ER2566(DE3)并诱导表达,分析利用3个不同载体所表达蛋白的表达量及表达形式。结果:利用BP反应构建了4个基因的重组质粒,用LR反应将这些基因分别克隆到表达载体,构建得到了相应的表达载体;诱导表达后的可溶性分析显示,含6×His和TRX标签的pHXGWA所表达的蛋白在表达量和可溶性方面均优于pDEST17和pHGGWA。结论:通过Gateway技术实现了布鲁菌抗原的快速克隆,筛选到的pHXGWA可作为后续大规模克隆表达载体,为布鲁菌抗原的大规模克隆表达和保护性抗原的筛选奠定了基础。     

载体介导的布鲁菌外膜蛋白疫苗研制现状

布鲁菌引起的布鲁菌病是严重危害人畜健康的传染性疾病,采用疫苗防治是当前研究的热点领域之一。外膜蛋白(OMP)是一种有效的疫苗候选分子,本文综述了鼠伤寒沙门菌、卡介苗、根癌农杆菌、大肠杆菌、毕赤酵母、禽流感病毒、山羊痘病毒和牛痘病毒等载体介导的布鲁菌OMP疫苗的研制现状。     

耐冷希瓦氏菌外膜蛋白的体外折叠研究

目的:旨在建立耐低温革兰氏阴性菌外膜蛋白体外折叠体系,为膜蛋白合成耐低温机制提供理论基础。方法:以包涵体的形式在大肠杆菌中过量表达了来源于耐低温希瓦氏菌的OmpA同源外膜蛋白Omp74的全蛋白质和N端跨膜结构域,纯化包涵体后,用高浓度尿素或强阴离子表面活性剂溶液溶解包涵体,以非离子表面活性剂为折叠介质,建立该外膜蛋白的体外折叠体系,同时以大肠杆菌的OmpA作为对照进行了比较研究。结果:与OmpA相比,Omp74体外折叠受温度影响较小,低浓度的阴离子表面活性剂能促Omp74的折叠,但对OmpA的折叠没有影响;C端结构域抑制Omp74在表面活性剂中的折叠;Omp74在0.5%的月桂酰基麦芽糖苷(DDM)和0.4%的十二烷基肌氨酸钠的混合溶液中能达到接近100%的折叠效率。     

毕赤酵母糖基化对布鲁菌P39抗原诱导巨噬细胞吞噬的影响

P39蛋白是通过蛋白组学从布鲁菌中鉴定出的具有较高免疫原性的优势抗原蛋白之一。本研究对布鲁菌的优势抗原蛋白P39基因在毕赤酵母中进行表达,并对其进行纯化及Western blot鉴定,利用核磁共振接合PNGaseF糖苷酶进行蛋白糖基化鉴定,并研究其与巨噬细胞相互作用的速度。结果表明,P39蛋白在毕赤酵母GS115中呈分泌表达,表达量可达5.05 g/L。核磁共振结果表明,重组P39蛋白被糖基化修饰。修饰后的蛋白被巨噬细胞捕获效应明显强于原核蛋白,说明糖基化修饰可能影响目标蛋白与细胞相互作用的效率,为进一步研究糖基化对P39蛋白的影响及布鲁菌糖基化疫苗候选抗原的研究提供参考。     

非编码小RNA BSR0602在布鲁菌环境适应能力中的调控作用

BSR0602是位于布鲁菌染色体上的非编码小RNA,在前期研究中我们发现,BSR0602与布鲁菌的胞内生存能力相关.为了进一步研究BSR0602对布鲁菌胞内环境适应能力的调控作用,采用双向电泳技术对布鲁菌野生株16M和BSR0602过表达株的全菌蛋白质谱进行比较分析.结果显示,BSR0602过表达后,布鲁菌转运代谢蛋白和压力适应蛋白的表达发生变化. qRT-PCR和HIS表位标记实验结果进一步证实,BSR0602在转录和翻译水平均影响氧压力适应蛋白SodA的表达.相关表型实验结果显示,BSR0602过表达株对氧压力更为敏感,证实了BSR0602在布鲁菌适应氧压力中的作用.结果表明,非编码小RNA BSR0602作为布鲁菌的转录后调控因子,可通过调控压力适应蛋白的表达来影响布鲁菌的压力适应能力和胞内生存.     

替加环素与米诺环素治疗布鲁菌病的进展

布鲁菌病是由布鲁菌引起的人畜共患传染性疾病，由带菌动物通过多种途径传染给易感人群，可侵犯人体各器官系统。目前推荐的抗布鲁菌治疗方案为多西环素、利福平、喹诺酮类、氨基糖类等抗菌药物组合的二联或者三联抗菌方案，但治疗无效率和疾病复发率仍较高。替加环素和米诺环素作为四环素类药物，经体外实验证明均可有效抑制布鲁菌，且50%最小抑菌浓度（50% minimal inhibitory concentration，MIC50） 和 90%最小抑菌浓度（90% minimal inhibitory concentration，MIC90）均较低。临床研究亦证实，包含替加环素和米诺环素的联合抗菌方案具有较低的治疗无效率和疾病复发率。因此，替加环素和米诺环素可作为治疗布鲁菌病的候选用药。本文就布鲁菌病传统治疗方案以及替加环素和米诺环素的抗菌效果进行综述。     

犬瘟热病毒N基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及应用

目的:为检测犬瘟热抗体提供诊断抗原,应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)N蛋白。方法:采用RT-PCR克隆CDV-N基因,构建重组杆粒BacmidCDV-N,并将其转染Sf9昆虫细胞。通过Western blot和间接免疫荧光检测N蛋白的表达。以表达的CDV N蛋白为包被抗原,建立了检测犬瘟热抗体的间接ELISA方法。结果:成功表达了CDV N蛋白。间接ELISA(iELISA)方法中,犬血清最佳稀释度1∶80,N蛋白稀释度1∶40(6.3μg/100μl)。应用该方法共检测了36份犬血清,与中和试验检测方法相比较,其特异性为81.8%,灵敏度为96.0%,符合率为91.7%。结论:表达的CDV-N蛋白具有良好反应原性,建立了快速检测CDV阳性血清的iELISA方法。     

032 布鲁菌病和伤寒血清学试验试剂条的评价

伤寒和布鲁菌病常引起血液感染。血及骨髓培养是最准确的诊断方法,在许多发展中国家,这两种疾病的诊断常凭临床表现和经验。血清学试验常被作为一种诊断工具,但肥达反应和布鲁菌试管凝集……     

布鲁菌病临床问答

2010年12月,4只未经检疫的山羊进入了我国某大学实验室。28名师生在实验后患上了布鲁菌病(brucellosis),此事在国内引起较大反响。有较多读者纷纷来信,希望了解该病当前临床进展。布鲁菌病和流行性脑膜炎、肺结核、登革热等传     

实时荧光PCR检测巴西孢子丝菌的实验方法的建立

目的建立一种快速、特异、灵敏的荧光PCR方法检测巴西孢子丝菌。方法比对NCBI数据库中所有巴西孢子丝菌内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列,在保守区域设计并合成特异性引物和探针,建立并优化荧光PCR检测方法。对优化后的方法使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价。通过巴西孢子丝菌小鼠感染模型,与组织培养比较,对本研究中的方法进行评价。结果建立的实时荧光PCR方法对巴西孢子丝菌的检测限为100fg。该方法对申克孢子丝菌、球形孢子丝菌、其他常见致病真菌28种、常见细菌3种以及人类基因组和小鼠基因组扩增结果均为阴性,特异度为100%。对巴西孢子丝菌感染小鼠脑、肝、肺、脾、肾及淋巴结检测与培养结果相一致。结论本研究建立的荧光PCR方法可快速、灵敏、特异地鉴定巴西孢子丝菌,并能够有效的对感染小鼠模型标本进行检测,有助于孢子丝菌病的早期特异性病原学诊断。