重组人白介素27真核表达载体的构建

目的克隆人IL-27基因,构建其真核表达载体。方法从人外周血单核细胞诱导而成的树突状细胞中提取总RNA,采用RT-PCR克隆人IL-27亚基EBI3和p28基因,Xho I和EcoR I双酶切后插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建人IL-27真核表达载体pcDNA3.1-EBI3和pcDNA3.1-p28。结果双酶切及测序结果表明构建载体中的EBI3与p28序列与文献报道一致。结论重组人IL-27真核表达载体的构建成功,为表达出有活性的重组人IL-27奠定了基础。     

辐射敏感性新基因UHRF1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建UHRF1的真核表达载体,并验证其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达。方法采用RT-PCR方法,从乳腺癌细胞MCF-7的总cDNA中扩增出2.3kb的UHRF1基因的cDNA片段,经限制性内切酶KpnⅠ与XhoⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组质粒pcDNA3（＋）-UHRF1,利用限制性内切酶双酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;构建成功的重组质粒,经脂质体Lipofactamin2000介导转染MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆,以RT-PCR和Western blot检测UHRF1的mRNA和蛋白的表达。结果获得全长约为2.3kb的UHRF1基因片段;重组质粒经限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ酶切、电泳后显示2.3kb的UHRF1目的片段和5.4kb的pcDNA3载体片段,即UHRF1基因的cDNA已正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;UHRF1转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后的RT-PCR和Western blot的结果显示：UHRF1的mRNA和蛋白水平均呈现高表达。结论成功构建UHRF1基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

介导人血红素加氧酶-1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建含人血红素加氧酶-1(HO-1)基因的重组pcDNA3.1质粒并进行鉴定.方法:利用分子生物学技术,从人肝脏标本中提取出RNA,进行RT-PCR后,做TA克隆,成功获得pMD/19-HO-1质粒,采用限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ从pMD/19-HO-1质粒中将目的基因片段切出,克隆到质粒pcDNA3.1的相应酶切位点中,构建重组质粒pcDNA3.1-HO-1,采用限制性酶切、DNA测序鉴定,将构建好的质粒瞬时转染ECV304细胞株,Western blot测定HO-1表达.结果:酶切、测序鉴定证实插入位点及方向与预期完全一致,测序证实hHO-1与Gene Bank提供的原始序列完全一致,瞬时转染细胞后HO-1蛋白表达明显增高.结论:成功构建了含人血红素加氧酶-1基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在糖尿病血管并发症中的作用奠定基础.     

尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fim H基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建以尿路致病性大肠杆菌临床分离株Ⅰ型菌毛编码基因fimH 为目的基因的真核表达载体pcDNA3.0-fimH.方法 提取尿路致病性大肠杆菌临床株基因组DNA,PCR扩增fimH基因片段,然后克隆至TA载体,通过PCR 、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段用限制性内切酶切下克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒.通过PCR 、酶切对重组质粒pcDNA3.0-fimH进行鉴定.结果 PCR 法克隆出全长为903 bp 的fimH基因并构建了pcDNA3.0-fimH重组质粒.结论 本研究成功构建尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达质粒pcDNA3.0-fimH,为尿路致病性大肠杆菌基因疫苗的研制奠定了基础.     

pEGFP-C2-人类P100蛋白SN和TD片段质粒构建

目的:分别构建含有人类p100蛋白SN片段和TD片段基因的真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C2-p100-SN和pEGFP-C2-p100-TD。方法:利用EcoRI和BamHI限制性内切酶对已构建好的质粒PSG5-p100-SN和PSG5-p100-TD进行双酶切以获得目的片段p100-SN和p100-TD基因片段,回收纯化后连接到质粒pEGFP-C2上。结果:通过对重组质粒进行菌落PCR鉴定以及酶切鉴定均能从PCR产物和酶切产物中观察到p100-SN和p100-TD片段。结论:成功构建了可以在真核细胞内表达绿色荧光蛋白和目的蛋白的融合蛋白的重组质粒pEGFP-C2-p100-SN和pEGFP-C2-p100-TD,可为有关人类p100蛋白功能及作用机制研究奠定基础。     

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

[目的]克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。[方法]采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。[结果]人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体,与Genebank中PAH基因序列一致。[结论]成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒,为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。     

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

 [目的]克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。[方法]采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。[结果]人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体,与Genebank中PAH基因序列一致。[结论]成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒,为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。     

NT4-p53（N37）-HA2-TAT融合基因的克隆和鉴定

目的 构建NT4-p53(N37)-HA2-TAT融合基因表达盒并进行序列分析. 方法 应用互补引物二次PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N37)基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序.扩增阳性重组质粒后用限制性内切酶切取p53(N37)和HA2-TAT片段连入pUC19/NT4质粒. 结果 克隆了p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pUC19/NT4-p53(N37)-HA2-TAT经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果显示酶切片段大小和理论值完全一致. 结论 通过基因克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N37)-HA2-TAT表达盒的pUC/19质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础.     

小鼠MME基因真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆小鼠巨噬细胞金属弹力酶(MME)基因结构域Ⅰ和Ⅱ,构建真核细胞表达载体,用于动物肿瘤原位种植模型的研究.方法通过PCR选择性扩增MME基因结构域Ⅰ和Ⅱ,克隆入pGEM-T载体中,限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切及PCR鉴定.结果以MME cDNA为模板进行PCR扩增的特异性片段在750 bp和1 000 bp之间.以此构建的pGEM-T-MME克隆载体和表达载体, 经限制性内切酶酶切证实载体中带有MME目的基因片段; 与小鼠MME cDNA序列的碱基符合率为99.63%; 证明MME基因已正确克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中.结论成功构建了pcDNA3.1-MME重组质粒,奠定了转基因研究MME表达与肿瘤生长转移关系的实验基础.     

CVB3-VP1基因与IL-15双表达质粒的构建

目的构建IL-15/CVB3-VP1的基因双表达重组质粒。方法从人胚肺二倍体细胞中提取IL-15的mR-NA,逆转录后将产物与pGEM-Teasy载体连接,转化DH5a大肠杆菌,筛选重组子并提取质粒进行酶切鉴定和测序。取双酶切的目的基因片断,与经过同样两种酶切的pcDNA3载体连接,经过转化、筛选和酶切鉴定后,构建成真核表达重组质粒PcDNA3-IL-15。用自行设计的引物从PcDNA3-VP1质粒上扩增出带有启动子的VP1基因,插入到PcDNA3-IL-15质粒上,构建成真核重组质粒PcDNA3-IL-15/CVB3-VP1。结果构建的PcDNA3-VP1/IL-15重组质粒目的基因与CVB3-VP1和IL-15的标准序列相同。结论成功构建了柯萨奇病毒VP1基因和人白细胞介素15基因双表达质粒PcDNA3-IL-15/CVB3-VP1。     

pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的构建与鉴定

[目的]从人角质形成细胞系HaCaT中克隆NRP1(Neuropilin-1)基因全长cDNA,构建含NRP1基因的重组真核表达载体,为下一步的NRP1基因功能研究奠定基础。[方法]采用RT-PCR法从人角质形成细胞系HaCaT中扩增NRP1基因全长cDNA,扩增产物通过TA克隆连接到pMD18-T载体进行测序鉴定,然后通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),最后得到pcDNA3.1(+)-NRP1重组质粒。[结果]成功克隆NRP1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体。[结论]pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的成功构建可以为NRP1基因功能的进一步研究及其临床基因治疗奠定实验基础。     

恶性疟原虫红内期p41-3基因真核表达重组质粒的构建及序列分析

[目的]构建恶性疟原虫海南(FCC1/HN)株p41-3基因真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3;测定p41-3基因序列,并了解FCC1/HN株与其它分离株p41-3序列的差异.[方法]根据p41-3基因已知序列设计合成2对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增p41-3基因;将p41-3基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;用酶切,PCR扩增鉴定筛选到的重组质粒阳性克隆.以正确的重组质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定p41-3基因序列,应用软件辅助分析p41-3序列及进行同源性比较.[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN株p41-3基因;正确的pcD-NA3-p41-3重组质粒被筛选和鉴定.测序表明,FCC1/HN株p41-3基因大小为2 137 bp,编码375个氨基酸.恶性疟原虫FCC1/HN株与FCBR株p41-3基因核苷酸序列同性为98.98%,编码氨基酸序列同源性为99.73%.[结论]从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中获取p41-3基因,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,并测定了FCC1/HN株p41-3基因的序列;FCC1/HN株与其它分离株p41-3基因有高度的同源性.     

人类TSLC1基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆人类TSLC1基因并构建其真核表达载体pcDNA3.1( )/TSLC1.方法:从正常皮肤组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增TSLC1基因全长cDNA,克隆入pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆,进行核苷酸测序分析,再将TSLC1基因定向克隆入pcDNA3.1( )载体中构建表达载体.结果:RT-PCR扩增后的产物在约1413 bp处出现明显的特异性条带,TSLC1基因的cDNA片段被成功插入真核表达载体pcDNA3.1( )质粒的多克隆位点,经鉴定与GenBank收录的TSLC1 cDNA 序列一致.结论:TSLC1基因的cDNA片段被成功克隆,为以后的研究奠定了基础.     

pcDNA3.1- Bcl-2真核表达载体构建

目的 克隆大鼠Bcl-2基因（B cell lymphoma）全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体, 测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒。结果: RT-PCR获得长度为720 bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3. 1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1- Bcl-2构建成功。结论 成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。     

6His—hVEGF165融合基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：本实验拟构建hVEGF165基因的真核表达载体,为其应用于治疗大鼠缺血皮瓣的研究奠定基础。方法：设计引物P1和P2,在每一个引物的两端分别添加BamHI、XhoI酶切位点。从人外周血中提取总RNA,用RT—PCR方法得到hVEGF165的cDNA。随后再将得到的cDNA连人中间载体pMD19-T,得到pMD19-T—hVEGF165,双酶切鉴定并测定序列。将hVEGF165的cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA6／HisA中,构建hVEGF165真核表达载体pcDNA6-hVEGF165。结果：对pMD19-T-hVEGF165的测序结果表明,本研究成功地从人外周血中扩增到hVEGF165的cDNA。将hVEGF165定向克隆人真核表达载体pcDNA6／HisA,经双酶切及PCR鉴定,将阳性克隆测序,经测序证实序列正确。结论：本研究成功地构建了VEGF165真核表达载体pcDNA6-hVEGF165,并且目的基因上游融合有His标签。     

pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒在Chang Liver细胞中的表达和鉴定

[摘要] 目的 构建pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒并建立人正常肝细胞Chang Liver的稳定表达株。方法 采用RT-PCR法从HepG2细胞中克隆得到UBE2C cDNA全长序列, 将之与pMD18-T载体连接。双酶切和测序鉴定后,再将UBE2C片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。构建好的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将其转入Chang Liver细胞株中,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再用Western blot法检测转染后UBE2C的蛋白表达水平。结果 pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实,目的基因UBE2C的序列完全正确,真核表达质粒成功构建。Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组UBE2C的蛋白表达水平高于转pcDNA3.1(-)组,具有统计学意义（P﹥0.01）。结论 成功构建UBE2C基因的真核表达质粒并建立其稳定表达的Chang Liver细胞株,为下一步研究奠定基础。     

转录抑制因子Bmi-1基因正、反义真核表达载体的构建及鉴定

[目的]克隆转录抑制因子Bmi-1基因并构建其正、反义真核表达载体，为研究其功能及其作用机制奠定基础。[方法]根据Bmi-1基因已知序列，设计合成一对引物，上下游引物分别加入XhoI和ClaI的酶切位点，用反转录PCR（RT-PCR）方法从人红白血病细胞株（K562）总RNA中扩增编码Bmi-1的基因片段（1017 bp），插入克隆载体pMD18-T，构建pMD18-Bmi-1载体，经限制性核酸内切酶谱证实后，再克隆至逆转录病毒载体pLNCX2中，构建pLNCX2-Bmi-1真核表达载体，并经测序证实。然后以pLNCX2-Bmi-1为模板，物扩增Bmi-1基因起始密码子及编码锌指结构区域上下171bp长度的核苷酸片段，并反向连接于表达载体（pLNCX2）上。[结果]DNA测序表明编码序列与读框完全正确，RT-PCR扩增出和目的片段相同的片段，正义DNA片断长度为1029bp，反义片断长度为171bp，Bmi-1基因被成功扩增并被克隆至真核表达载体pMD18-T和pLNCX2中。[结论]Bmi-1正义及反义片断被成功扩增，并成功构建了Bmi-1正、反义重组真核表达载体，为进一步研究该基因打下了基础。     

TIMP-3基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌MDA-MB-453细胞生长及侵袭的抑制作用

目的: 构建组织基质金属蛋白酶抑制剂3(TIMP-3)真核表达载体并转染乳腺癌MDA-MB-453细胞,探讨TIMP-3对MDA-MB-453细胞生长及侵袭的抑制作用。 方法: 采用RT-PCR法从人新鲜胎盘组织中获得TIMP-3 cDNA,连接至pMD18-T载体,EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切pMD18-T-TIMP3重组质粒及pcDNA3.1载体并连接,构建pcDNA-TIMP-3真核载体,酶切鉴定、测序。将乳腺癌MDA-MB-453细胞分为正常对照组、pcDNA空载体组(只转染pcDNA空载体)和pcDNA-TIMP-3组(转染pcDNA-TIMP-3)。Western blotting法测定蛋白表达,采用MTT法和Boyden小室侵袭实验测定各组细胞的增殖活性及侵袭能力。 结果: 重组载体经过EcoRⅠ 和XbaⅠ酶切后,产生633bp的TIMP-3目的片段和pcDNA3.1线性化载体,经自动测序仪测定TIMP-3序列完全正确。转染重组载体后MDA-MB-453细胞稳定表达了TIMP-3,与正常对照组和pcDNA空载体组比较,pcDNA-TIMP-3组细胞增殖活性明显降低(P<0.05),穿透以Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、层黏连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)和玻璃连接蛋白(VN)包被的Matrigel膜的侵袭细胞数明显减少(P<0.05)。 结论: 成功构建pcDNA3.1-TIMP-3真核表达载体,可在MDA-MB-453细胞中高表达TIMP-3蛋白,并对MDA-MB-453细胞生长及侵袭性有抑制作用。     

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并转染293T细胞以表达其编码的蛋白?方法:从南京分离株H7N9流感病毒[A/Nanjing/1/2013(H7N9)]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T 载体中构建pMD18-T-NS1质粒,以pMD18-T-NS1质粒为模板扩增NS1基因?双酶切NS1基因PCR产物与PXJ40-MYC后,连接构建真核表达载体PXJ40-MYC-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达?结果:经双酶切?测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功?Western blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达?结论:成功构建了H7N9非结构蛋白NS1真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究奠定基础?     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建pcDNA3.1(-)/NNMT(尼克酰胺-N-甲基化酶)真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1/NNMT重组质粒中克隆得到NNMTcDNA全长序列,并将扩增的cDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT-PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功,经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。