小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的 :克隆小鼠血管抑素 (Angiostatin)cDNA ,构建其真核表达载体pCMV -Angiostatin重组质粒 ,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法 :根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列 ,用RT -PCR方法从鼠肝脏中扩增出AngiostatincDNA ,连接 pMD18T载体测序 ,经测序证实后 ,通过中间载体 pKS ,构建pCMV -Angiostatin重组质粒。结果 :测序表明扩增的AngiostatincDNA序列与报道基本一致 ,AngiostatincDNA正确插入表达载体。 结论 :成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建     

小鼠血管抑素基因的克隆、测序与真核表达载体的构建

目的：克隆小鼠血管抑素（mAS)基因，测序并构建其真核表达载体。方法：从小鼠肝组织中提取总RNA，用RT－PCR方法将mAS的cDNA扩增出，克隆到pcDNA3真核表达载体中，测定其DNA序列。结果：测序结果表明我们克隆的血管抑素基因，其序列与GenBank中鼠的mAS基因序列有4个碱基不同，所编码的氨基酸有3个发生突变。结论：已成功构建鼠mAS的真核表达载体，为进一步应用AS进行肿瘤基因治疗研究打下基础。     

小鼠T细胞活化衔接因子基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T细胞活化衔接因子(LAT)基因的真核表达载体。方法以小鼠单个核细胞的cDNA为模板,采用PCR扩增LAT基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pCMV-HA中;测序鉴定目的基因并转染哮喘小鼠脾脏淋巴细胞。结果PCR扩增的特异性片段长度为729 bp,并以此构建重组质粒pCMV-HA-LAT。质粒测序结果与GenBank中的小鼠LAT基因cDNA序列一致;转染哮喘小鼠淋巴细胞后可检测到LAT蛋白的表达。结论成功构建了pCMV-HA-LAT重组真核表达载体。     

小鼠T细胞活化衔接因子基因真核表达载体的构建

目的 构建小鼠T细胞活化衔接因子(LAT)基因的真核表达载体.方法 以小鼠单个核细胞的cDNA为模板,采用PCR扩增LAT基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pCMV-HA中;测序鉴定目的基因并转染哮喘小鼠脾脏淋巴细胞.结果 PCR扩增的特异性片段长度为729 bp,并以此构建重组质粒pCMV-HA-LAT.质粒测序结果与GenBank中的小鼠LAT基因cDNA序列一致;转染哮喘小鼠淋巴细胞后可检测到LAT蛋白的表达.结论 成功构建了pCMV-HA-LAT重组真核表达载体.     

小鼠IL-33基因cDNA克隆与真核质粒的构建与表达

目的克隆小鼠IL-33基因（mIL-33）cDNA构建其真核表达质粒,并转染EL-4细胞检测其表达。方法提取小鼠脑与肺组织总RNA,经逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因cDNA,酶切后插入pcDNA-3.1构建其真核表达载体pcDNA-mIL-33,重组质粒转染EL-4细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。结果 pcDNA-mIL-33中插入的DNA序列测定结果与mIL-33 cDNA序列一致,重组质粒转染EL-4细胞后检测到相应基因表达。结论成功克隆小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

人类p27kip1基因正、反义真核表达质粒的构建

目的：克隆人类p27^kip1基因，构建其正、反义真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人类伯基特淋巴瘤细胞株Raji中扩增出人类p27^kip1 cDNA全长序列，通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1真核表达载体上，构建p27^kip1正、反义表达质粒。通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，本实验构建的重组表达质粒目的基因片段为人类p27^kip1 cDNA。结论：本实验成功地克隆了人类p27kipl基因并构建了其正、反义真核表达质粒，为进一步研究p27^kip1在淋巴瘤发生中的意义奠定了基础。     

含小鼠分泌型内皮抑素基因重组质粒的构建及表达

目的:克隆小鼠分泌型内皮抑素(sEndostatin)cDNA,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,检测重组质粒在B16细胞中的表达. 方法:用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出内皮抑素cDNA,经测序证实后,连入信号肽,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,以脂质体转染小鼠B16细胞,用Western blot方法检测B16细胞上清中内皮抑素的表达.结果:测序表明扩增的分泌型内皮抑素序列与报道完全一致, Egr-1启动子和分泌型内皮抑素cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1,Western blot证实转染B16细胞上清中有目的蛋白表达.结论:小鼠内皮抑素基因成功地被克隆和表达,为今后检测pEgr-分泌型内皮抑素的辐射诱导表达和恶性肿瘤的基因-放射治疗奠定基础.     

小鼠Hsp84真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建小鼠Hsp84基因真核表达质粒。方法：采用逆转录、热降落PCR方法，扩增BALb／c小鼠Hsp84基因片段。将其连人pMD18-T载体，筛选阳性克隆、测序验证。然后以重组T载体为模板，PCR扩增目的序列，插入真核表达质粒pcD—NA3.1中，转化大肠杆菌DH5α，通过琼脂糖电泳、双酶切挑选和验证阳性重组克隆。结果：RT—PCR自小鼠脑组织中扩增出目的基因片段，克隆人pMD18-T载体后，测序结果证明为BALb／c小鼠Hsp84基因．插入目的基因的真核表达载体的酶切谱与设计一致。结论：成功构建了小鼠Hsp84编码框全长的真核细胞表达质粒。     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

人骨骼肌TnI-fast基因克隆和体外表达

目的：构建人骨骼肌TnI-fast基因分泌型真核表达载体，为利用TnI-fast基因进行抗肿瘤血管生成基因治疗奠定基础。方法：采用PCR和RT－PCR制备TnI-fast cDNA，构建TnI-fast基因克隆质粒，测序证实后将TnI-fast cDNA插入到pSecTag2B构建分泌型重组真核表达质粒。然后用TnI-fast基因重组表达质粒转染COS－1细胞，检测TnI-fast基因体外表达。结果：DNA测序证实，我们从人骨骼肌总RNA和cDNA文库中扩增的TnI-fas cDNA序列与NCBIGenebank TnI-fast cDNA序列完全一致。ELISA检测证实，TnI-fast/pSec Tag2 B转染后目的基因可在真核细胞中分泌表达。结论：本研究成功地构建了TnI-fast基因重组表达质粒，可进一步用于抗肿瘤血管生成基因治疗动物实验。     

人可溶性血管内皮生长因子受体-2基因的克隆与鉴定

目的获取人可溶性血管内皮生长因子受体-2(sKDR)基因,构建sKDR基因真核表达载体,为进一步研究sKDR抗肿瘤血管生成的基因治疗奠定基础。方法提取人胎盘组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得sKDR基因cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中,测序证实后,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pMD18-T-sKDR重组载体,胶回收sKDR基因,再将其定向亚克隆到真核表达载体pCMV-Script中,提取质粒做双酶切和测序鉴定。结果构建的重组sKDR基因真核表达载体pCMV-Script-sKDR分别做双酶切和测序鉴定,证实其中含有sKDR基因,测序结果经BLAST分析,与预期设计的编码区cDNA序列一致。结论成功克隆了人sKDR基因的真核表达载体。     

pEgr-sHemopexin重组质粒的构建及体外辐射诱导表达

目的：克隆小鼠分泌型Hemopexin (sPEX) 编码区的cDNA序列,构建含Egr-1启动子的pEgr-sPEX真核表达载体,检测辐射诱导重组质粒在B16F10细胞中的表达。 方法：用RT-PCR从NIH3T3细胞中扩增出sPEX,经测序证实后,构建pEgr-sPEX重组质粒,以脂质体转染B16F10细胞,用Western blotting方法检测B16F10细胞上清中辐射诱导PEX的表达。 结果：测序表明扩增的sPEX cDNA序列与GenBank中登录的序列完全一致,sPEX cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1-Egr-1,转染入B16F10细胞内PEX基因在体外辐射诱导下成功获得表达。结论：成功地克隆了小鼠sPEX基因,并在体外证实了pEgr-sPEX具有辐射诱导表达特性。     

人血管内皮生长因子基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段。构建pcDNA3／VEGF165真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人肝癌细胞株SMMC-7721中扩增出血管内皮生长因子VEGF165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3真核表达载体上,构建成pcDNA3／VEGF165重组质粒,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果：经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实,本实验构建的重组质粒目的基因片段为人VEGF165cDNA。结论：本实验成功地克隆了VEGF165基因并构建了其真核表达质粒。为进一步研究用VEGF基因转染的方法来恢复或增强放疗后组织的血管生成能力奠定了基础。     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及其重组真核表达载体的构建

目的：构建α1,3-半乳糖基转移酶的重组真核表达质粒pcDNA3.1/V5-HisAα1,3GT,为进一步利用其进行胃癌的基因治疗奠定基础。方法：从BALB／c小鼠腹腔巨噬细胞中提取总RNA，行RT－PCR扩增出编码α1,3-半乳糖基转移酶的全长cDNA，并克隆入pUCm-T测序载体。经DNA测序证实序列无误后，将α1,3-半乳糖基转移酶基因片段亚克隆入pcDNA3.1/V5-HisA真核表达载体。结果：经RT－PCR扩增出大小约为1．2kb的基因片段，成功克隆入pUCm-T载体。经DNA测序证实为α1,3-半乳糖基转移酶（α1,3-galactosyltransferase,3GT），大小为1221bp，编码序列及读框均正确。经亚克隆酶切鉴定，获得携有α1,3GT基因的重组质粒pcNDA3.1/V5-HisAα1,3GT。结论：成功地构建α1,3GT真核表达载体，为进行肿瘤基因治疗奠定了基础。     

人核糖体蛋白L6编码基因的克隆及正反义真核表达载体的构建

目的：通过克隆人核糖体蛋白L6（RPL6） cDNA序列，构建其正反义真核表达载体，以探讨RPL6与白血病多药耐药的关系。方法：用RT—PCR技术扩增RPL6 cDNA序列，DNA重组技术构建其正反义真核表达载体。结果：成功扩增RPL6 cDNA序列，经DNA测序，证实与GenBank中的人RPL6编码区序列一致，酶切证实目的基因分别按正反两个方向亚克隆至真核表达载体。结论：成功克隆人RPL6 cDNA序列，并构建了正反义真核表达载体。     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体构建

目的获得人血管内皮生长因子（hVEGF165）cDNA,构建其真核表达载体。方法采用PCR技术,从HL60细胞中扩增出hVEGF165 cDNA,将其克隆至pcDNA3真核表达载体上,构建成为pCD-hVGEF165重组质粒。结果经酶切鉴定,克隆的基因片段为人hVGEF165 cDNA;建立了pCD-hVGEF165重组质粒。结论成功地克隆和表达出了人VEGF165基因,为大量制备重组质粒的研究奠定了基础。     

pcDNA3.1- Bcl-2真核表达载体构建

目的 克隆大鼠Bcl-2基因（B cell lymphoma）全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体, 测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒。结果: RT-PCR获得长度为720 bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3. 1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1- Bcl-2构建成功。结论 成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。     

人可溶性血管内皮生长因子受体-1基因的克隆与鉴定

目的获取人可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)基因,构建sFlt-1基因真核表达载体,为进一步研究sFlt-1抗肿瘤血管生成的基因治疗奠定基础。方法提取人胎盘组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得sFlt-1基因cDNA,将其克隆到pUCm-T载体中,测序证实后,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pUCm-T-sFlt-1重组载体,胶回收sFlt-1基因,再将其定向亚克隆到真核表达载体pCMV-Script中,提取质粒作双酶切和测序鉴定。结果构建的重组sFlt-1基因真核表达载体pCMV-Script-sFlt-1分别作双酶切和测序鉴定,证实其中含有sFlt-1基因,测序结果经BLAST分析与预期设计的编码区cDNA序列完全一致。结论成功克隆了人sFlt-1基因的真核表达载体。