嵌合泛素连接酶TrCP-CC及其突变体△F-CC重组腺病毒的构建及鉴定 |
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作者姓名: | 罗红伟 袁颖 季茂胜 刘钉宾 王晓飞 曹唯希 冯文莉 |
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作者单位: | 罗红伟,季茂胜,刘钉宾,王晓飞,曹唯希,冯文莉(重庆医科大学临床血液学教研室临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆,400016);袁颖(重庆医科大学附属第一医院普外科,重庆,400016) |
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摘 要: | 目的构建嵌合泛素连接酶TrCP-CC及其突变体△F-CC的重组腺病毒,并检测其表达。方法采用PCR和重叠PCR法构建真核表达质粒Migr1-TrCP-CC-HA和Migr1-△F-CC-HA,以此为模板,通过PCR将其克隆至穿梭质粒pAd-Track-CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-TrCP-CC和pAdTrack-△F-CC,再与骨架载体pAdeasy-1经同源重组得到重组腺病毒质粒pAd-TrCP-CC和pAd-△F-CC,转染HEK293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒Ad-TrCP-CC和Ad-△F-CC,测定其滴度,并经RT-PCR检测目的基因的转录水平。结果经酶切和测序证实重组腺病毒质粒pAd-TrCP-CC和pAd-△F-CC构建正确,经HEK293细胞包装后显微镜下可观察到绿色荧光,病毒滴度分别为2.5×109和1.0×109pfu/L,经RT-PCR检测目的基因可有效表达。结论已成功构建重组腺病毒Ad-TrCP-CC和Ad-△F-CC,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步研究其靶向融合蛋白Bcr-Abl泛素化和降解的机制奠定了基础。
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关 键 词: | β-TrCP 突变 腺病毒科 泛素蛋白连接酶类 |
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