人Endostatin在毕赤酵母菌中的表达及其抑癌活性研究

目的：在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin。方法：一步法抽提胎肝总RNA，RT－PCR扩增endostatin全基因，用T－A克隆技术的构建克隆载体；双酶切回收550bp的endostatin基因，亚克隆入酵母表达载体。重组质粒分别以PCR，酶切及测序鉴定。电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS115感受态细胞，SDS－PAGE电泳筛选阳性重组子，G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白，MRR法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果：RT－PCR获得550bp的特异扩增条带，T－A克隆后，PCR挑选阳性重组子，测序证实序列正确。亚克隆后的表达载体，PCR可得550bp的特异条带，EcoRI,Not I双酶切获得550bp和3kb的条带，与预期一致，DNA测序证明核苷酸序列100％的正确，SDS－PAGE证实重组菌较空白有一明显条带，Heparin亲和层析后，1mol/L NacL洗脱的蛋白峰大体外可转异性抑制血管内皮细胞的增殖。结论：在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白。