自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的：探讨自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞株（HK-2）凋亡中的作用。方法：培养HK-2细胞，根据培养环境氧浓度不同分为对照组（21%O2）和低氧组（1%O2）；根据低氧培养时间不同，低氧处理细胞进一步分为：低氧6 h亚组、低氧12 h亚组、低氧18 h亚组和低氧24 h亚组。Western blot检测HK-2细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和凋亡相关蛋白活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cleaved-caspase3）表达水平，流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡情况；采用低氧诱导稳定表达GFP-LC3的HK-2细胞18 h，在荧光显微镜下观察GFP-LC3自噬小体的变化；进一步采用低氧联合自噬诱导剂雷帕霉素（ra－pamycin，RP）或自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1，BAfA1）处理HK-2细胞，细胞分为常氧对照组、常氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组、低氧对照组、低氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组。Western blot检测Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和cleaved-caspase3表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：与对照组（0.161±0.043）相比较，低氧12 h[（0.315±0.060），P=0.019]、18 h[（0.586±0.063），P=0.000]、24 h[（0.698±0.085），P=0.000]亚组HK-2细胞cleaved-caspase3蛋白表达明显增多；低氧12 h、18 h、24 h亚组HK-2细胞凋亡率分别为（23.633±5.346）%、（25.200±4.782）%、（38.567±8.046）%，较对照组（11.800±3.966）%明显增多（P=0.036，P=0.021，P=0.000）。同时，低氧18 h、24 h亚组HK-2细胞表达Beclin1蛋白[（0.557±0.071），（0.897±0.074）[较对照组（0.249±0.040）明显上调（P=0.001，P=0.000）；低氧6 h、12 h、18 h、24 h亚组细胞表达LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白[（1.795±0.143），（2.873±0.078），（3.029±0.089），（3.735±0.059）]较对照组（1.322±0.191）明显上调（P=0.036，P=0.000，P=0.000，P=0.000）；细胞表达自噬底物P62蛋白[（0.776±0.061），（0.602±0.119），（0.419±0.117），（0.384±0.068）]较对照组（0.957±0.035）明显下调（P=0.028，P=0.001，P=0.000，P=0.000）；低氧组细胞GFP-LC3斑点计数相对值为（40.667±6.028），较对照组（18.667±5.508）明显增加（P=0.010）。雷帕霉素增加自噬后，低氧诱导的HK-2细胞凋亡（26.433±3.402）及cleaved-caspase3蛋白表达（0.265±0.066）较低氧对照组[（36.133±5.856），（0.358±0.060）]明显减少（P=0.012，P=0.000）；巴弗洛霉素A1抑制自噬后，低氧诱导的HK-2细胞凋亡增多（49.233±3.412）及cleaved-caspase3蛋白表达（1.242±0.110）较低氧对照组[（25.933±3.650），（0.659 ± 0.060）]明显增加（P=0.000，P=0.000）。结论：自噬在低氧诱导的HK-2细胞凋亡中起保护作用。

Effect of autophagy on the hypoxia-induced human renal proximal tubular cell apoptosis