BGC-823细胞中慢病毒途径针对HIF-1α基因的RNAi实验 |
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作者姓名: | 毛竹君 魏品康 武峰 张慈安 孟先泽 赵婧 赵圣佳 张璇 陆烨 |
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作者单位: | 上海长征医院中医科,上海,200003 |
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摘 要: | 目的:构建人HIF-1α基因的shRNA慢病毒载体、包装生产重组慢病毒颗粒,病毒途径高效感染胃癌细胞株BGC-823,并验证基因沉默效率。方法:在NCBI数据查找人HIF-1α基因序列,然后使用siRNA在线设计软件,设计针对基因CDS区的3条siRNA序列及Negative序列。根据设计好的siRNA序列设计双链互补的shRNA-Oligo DNA,退火形成双链后与线性化载体链接,构建shRNA重组表达载体。经由293TN细胞包装shRNA重组慢病毒颗粒,随后使用重组病毒感染BGC-823,通过荧光标记蛋白GFP确定感染效率后收集细胞样本,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果:shRNA重组表达载体测序结果与设计序列完全一致,包装病毒后滴度达到1×104 ifu/μL。慢病毒感染BGC-823细胞取得了极高的基因转导效率。mRNA检测结果显示,siRNA3对于对与目的基因的沉默效果最好,较阴性对照序列组相比较,mRNA的表达量下降了92%,Western blot检测的结果与mRNA检测结果完全相符合。结论:通过慢病毒途径,可以在BGC-823细胞中高效的进行HIF-1α基因的沉默。
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关 键 词: | HIF-1α 慢病毒 RNAi BGC-823 |
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