14-3-3ε蛋白在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中对Cdc25B定位的影响

目的：探讨14-3-3ε蛋白在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中对Cdc25B定位的影响，为阐明14-3-3ε蛋白对小鼠卵母细胞发育的调控机制奠定基础。方法：采用超排卵方法获得3周龄昆明系雌性小白鼠生发泡（GV）期卵母细胞分为未注射组、control siRNA注射组和14-3-3εsiRNA注射组。构建pmax-FP-Red-HA-14-3-3ε表达载体。间接免疫荧光技术检测14-3-3ε蛋白和Cdc25B在小鼠卵母细胞中的定位；直接免疫荧光技术观测14-3-3ε蛋白和Cdc25B蛋白在小鼠卵母细胞中的亚细胞定位；利用显微注射方法将14-3-3εsiRNA注射入GV期卵母细胞中，相差显微镜下观测卵母细胞的形态表现，计算卵母细胞的生发泡破裂（GVBD）发生率；Western blotting法检测卵母细胞中14-3-3ε蛋白的表达和Cdc2-pTyr15蛋白的相对表达水平；放射自显影检测卵母细胞中成熟促进因子（MPF）的活性。结果：间接和直接免疫荧光实验，野生型Cdc25B能与14-3-3ε蛋白共定位于细胞质；在GVBD前期，Cdc25B由胞浆穿梭进入细胞核。当Cdc25B蛋白的第321位丝氨酸突变为丙氨酸时，14-3-3ε蛋白的表达水平降低，Cdc25B的胞浆定位被取消。未注射组、control siRNA注射组卵母细胞在显微注射24 h后均未发生GVBD，GVBD发生率组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；14-3-3εsiRNA注射组在显微注射后22和24 h卵母细胞的GVBD发生率均高于未注射组和control siRNA注射组（P<0.01），显微注射后24 h卵母细胞到达第2次减数分裂中期（MⅡ）的比例高于未注射组和control siRNA注射组（P<0.01）。结论：在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中，Cdc25B的Ser321位点可能是14-3-3ε蛋白调控Cdc25B细胞内定位的具体作用位点。