丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶突变体MEKK3~(KI)的构建及功能鉴定

有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶MEKK3(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase3)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于MAP3K(mitogen-activated protein kinase kinase kinase)家族,其在细胞增殖、凋亡、炎症反应、肿瘤的发生中发挥了重要的作用。利用分子克隆手段构建激酶功能失活(kinase inactive)型突变体MEKK3KI(391位赖氨酸突变为甲硫氨酸,K391→M391)的真核表达载体,并通过检测MEKK3KI蛋白对NudC的磷酸化作用及对细胞周期的影响以鉴定其生物活性。根据GenBank提供的人源MEKK3的cNA序列(NM_203351),扩增出野生型MEKK3(MEKK3~(WT))的目的基因,用重叠延伸PCR定点突变技术扩增激酶功能失活型MEKK3KI目的基因,并将其分别克隆至带有FLAG标签的真核表达载体p CMV-tag-2c和带有GFP标签的真核表达载体pEGFP-C1中。DNA序列分析结果显示,MEKK3KI基因序列成功将391位点的赖氨酸(K)突变为甲硫氨酸(M),表明突变体构建成功;免疫印迹分析显示,MEKK3~(WT)、MEKK3KI重组体均在He La细胞中高效表达;体外模拟磷酸化实验结果显示,野生型MEKK3~(WT)在体外可以磷酸化NudC,而激酶功能失活型突变体MEKK3KI无法将其磷酸化;激光共聚焦显微镜观察发现,野生型MEKK3在HeLa细胞中过表达,细胞核形态异常,与凋亡细胞核形态相似,而失活型MEKK3过表达不会导致细胞核明显变化。总之,本实验成功构建了野生型、失活型MEKK3的真核表达载体,同时发现其可以磷酸化NudC,促进细胞凋亡,为进一步揭示MEKK3生物学功能奠定了基础。