含VEGFP驱动双自杀基因重组腺病毒的制备及其体外抑瘤作用的观察

目的:应用AdEasier1系统高效制备含血管内皮生长因子启动子(vascular endothelial growth factor promoter,VEGFP)驱动双自杀基因的重组腺病毒,并观察其体外肿瘤杀伤作用。方法:首先,用NotⅠ和XhoⅠ切下pEGFP1SVVEGFP上的VEGFP,亚克隆至pAdtrack构建pAdtrackVEGFP;再分别以JM109细菌和pREP8TK为模板,PCR扩增出CD和TK基因片段,亚克隆到中间载体pcDNA3构建含CDglyTK融合基因的pcDNA3CD/TK。用HindⅢ和PvuⅡ酶切,回收纯化含polyA的片段CDglyTKpA,插入pAdtrackVEGFP构建转移质粒pAdtrackVEGFPCD/TK,经PmeⅠ线性化后转化AdEasier1细菌。用25μg/mL卡那霉素筛选阳性克隆,先后进行琼脂糖电泳和PacⅠ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasyVEGFPCD/TK,经293细胞包装、扩增获得重组腺病毒AdVEGFPCD/TK,行PCR鉴定。通过测定细胞克隆形成率和细胞生存率观察重组腺病毒对体外培养的LOVO细胞的毒作用。结果:包装扩增后重组腺病毒的滴度为3.2×1011病毒颗粒/mL,PCR扩增结果与预期相符。在前药5氟胞嘧啶(5fluorocytosine,5FC)和更昔洛韦(ganciclovir,GCV)存在下,重组腺病毒对LOVO具有明显杀伤作用,细胞克隆形成率和细胞生存率都明显下降。结论:应用AdEasier1系统可以成功制备含VEGFP驱动CD/TK自杀基因的重组腺病毒,该重组体具有明显的肿瘤杀伤作用。

Construction of adenovirus-mediated CD/TK suicide gene driven by VEGFP and its anti-tumor effect in vitro