大肠杆菌四氢嘧啶合成途径的构建与优化

为了构建重组工程菌株发酵合成四氢嘧啶,解决野生型菌株对高盐环境的依赖,作者克隆了来自伸长盐单胞菌(Halomonas elongata ATCC 33173)的四氢嘧啶合成相关基因簇ectABC并在大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)中重构了四氢嘧啶的合成途径。通过宿主比较发现,与E. coli W3110、E. coli DH5α和高产天冬氨酸的大肠杆菌(命名为E. coli(asp))相比,E. coli BL21(DE3)更适用于四氢嘧啶的合成(185.23 mg/L)。进一步分析了不同拷贝数的表达系统对四氢嘧啶合成的影响,发现高拷贝的pRSFDuet-1为载体时产四氢嘧啶量最高,达267.3mg/L。在此基础上,采用核糖体结合位点(RBS)优化策略,对四氢嘧啶合成途径3个酶EctA、EctB与EctC进行了组合优化表达,四氢嘧啶产量提高至521.24 mg/L。为强化前体天冬氨酸和天冬氨酸β-半醛的供给,对天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶和天冬氨酸裂解酶进行了过量表达。研究表明,单独强化天冬氨酸激酶的表达更有利于四氢嘧啶的合成(551.24 mg/L),为构建高产四氢嘧啶的工程菌种提供了新的策略。

Construction and Optimization of Ectoine Synthesis Pathway in Escherichia coli