转染癌基因的骨髓基质干细胞体外分化特征

目的:观察转染癌基因的骨髓基质干细胞在体外分化情况,为肝细胞癌的细胞源研究提供实验依据。方法:实验于2003-05/2004-06在南方医科大学药理教研室实验室完成。①两步法获取大鼠肝细胞,梯度离心法分离大鼠骨髓基质干细胞。②单基因转染是单独将c-myc或K-ras癌基因瞬时转染大鼠骨髓基质干细胞,6孔培养板中培养,24h后荧光显微镜下观察骨髓基质干细胞转染结果。双基因转染步骤相同,只是将c-myc和K-ras癌基因同时转染大鼠骨髓基质干细胞。③c-myc癌基因转染组、K-ras癌基因转染组、双癌基因转染组常规培养,加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养基,于37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱培养,每24h半量更换培养液。④c-myc癌基因转染 肝细胞组、K-ras癌基因转染 肝细胞组、双癌基因转染 肝细胞组将已转染癌基因的骨髓基质干细胞,置于叠加的培养板半透膜的上方(细胞密度均为1×105个/cm2),再将肝细胞置于半透膜的下方(每孔细胞密度为3×105/cm2)进行共培养,其余步骤同常规培养。⑤通过反转录聚合酶式反应和细胞免疫组化检测骨髓基质干细胞分化情况。结果:①癌基因转染24h骨髓基质干细胞检测结果:单独转染c-myc或K-ras癌基因的细胞,其绿色荧光蛋白呈均匀一致分布;双基因转染的细胞,绿色荧光蛋白呈点片状分布。②各组骨髓基质干细胞向肿瘤细胞分化检测结果:c-myc癌基因转染组、K-ras癌基因转染组、双癌基因转染组的骨髓基质干细胞,均未向肿瘤细胞分化;c-myc癌基因转染 肝细胞组、K-ras癌基因转染 肝细胞组、双癌基因转染 肝细胞组的骨髓基质干细胞,均向肝细胞癌发展;空白对照组骨髓基质干细胞细胞均为阴性。此外,双癌基因转染 肝细胞组的骨髓基质干细胞分化增殖迅速,反转录聚合酶式反应和免疫组化检测发现,培养第7天出现甲胎蛋白表达,并迅速增加,而第7天出现的白蛋白和细胞角蛋白18表达迅速减弱,第14天消失。结论:转染癌基因的骨髓基质干细胞,在向肝细胞诱导的条件下,部分癌基因可以使干细胞分化为肝癌细胞;多癌基因转染时,更易于使干细胞分化为肝癌细胞。

Characteristics of in vitro differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells transfected with oncogene