7-木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl—pl-1及Lxyl-pl-2的催化特性

糖基水解酶Lxyl-pl－1和Lxyl-p1-2是天然药物活性物质与功能国家重点实验室，卫生部天然药物生物合成重点实验室克隆自真菌香菇的重组蛋白，具有β-木糖苷酶／β-葡萄糖苷酶双重活性，能专一性水解脱除7-木糖-10-去乙酰紫杉醇等的木糖基，生成的C-7位羟基化产物可以作为前体半合成重要的抗肿瘤药物紫杉醇或其类似物。前期工作显示：Lxyl-p1-1和Lxyl-p1-2的序列同源性高达97％，但后者的催化活性是前者的2倍以上；Lxyl—pl-2水解生色底物PNP-Xyl的最适温度为50℃，最适pH为4．0。为系统地观察两酶的催化特性，在对天然药物活性物质与功能国家重点实验室，卫生部天然药物生物合成重点实验室构建的工程酵母进行培养、诱导7d后冷冻干燥菌体。将冷干的菌体破碎得到蛋白粗提物，再经过Ni亲和色谱和HPLC凝胶色谱法制备和纯化得到Lxyl-p1-1和Lxyl-p1-2重组蛋白。以生色底物PNP-Xyl和PNP-Glc及7-木糖紫杉烷底物7．木糖-10-去乙酰紫杉醇（XDT）与重组酶进行反应，重点测定Lxyl-p1-2水解XDT的最适温度和最适pH，并在最适条件下测定重组酶对不同底物的动力学参数。试验结果表明：Lxyl-pl-2水解底物XDT的最适温度为45％，最适pH为4．5；动力学测定结果显示：Lxyl—pl-1和Lxyl-p1-2的β-葡萄糖苷酶活性均显著高于其β-木糖苷酶活性，这与之前的研究结果相一致；Lxyl-p1-1对于底物PNP-Xyl，PNP-Glc和XDT的kcat／Km值分别低于Lxyl-p1-2对于上述3种底物的kcat／Kan值（0．77s-1×mM-1，1．65s-l×mM-1和-1×mM-lVS．1．67S-1xmM-1，2．85S-1×mM-1和1．07S-1×mM-1）。