Fine T-Cell Subsets in Alcoholics as Determined by the Expression of l-Selectin, Leukocyte Common Antigen, and β-Integrin

Alcoholics admitted to the hospital solely for detoxication have been studied by flow cytometry to evaluate changes in the surface markers of peripheral blood leukocytes. As we have shown previously, such patients have an elevated percentage of CD8^hl lymphocytes that are HLA DR⁺; we now demonstrate that they also have striking alterations in the quantitative relationships of the fine T-cell subsets. Both CD4⁺ and CD8^hl lymphocytes have a sharply reduced percentage of the l -selectin⁺ CD45RA⁺ subset, increased percentages of the CD45RA-subsets, and several other fine subset alterations. The fine subset profile suggests, according to current correlations of phenotype and function, that both CD4⁺ suppressor inducer and CD4-dependent CD8⁺ suppressor effector cells are reduced, whereas other subsets, including CD8⁺ CTL or their precursors, are increased in relative percentages. Some of the phenotypic changes are reversible over the several days following withdrawal. In other results, the percentage of CD8^hl lymphocytes expressing CD11b (β-integrin) is shown to be reciprocal with the percentage expressing l -selectin both in normals and alcoholics. However, the regression function of CD11b vs. l -selectin on CD8^hl cells is different for the alcoholics than for the normals, indicating an abnormality in the regulation of the expression of these two adhesion markers. Taken together, this abnormality of adhesion molecules and the fine subset alterations previously described indicate widespread changes in the peripheral lymphocytes of currently drinking alcoholics. These changes suggest functional deficiencies that may include alterations of lymphocyte traffic and other adhesion-dependent functions, and a shift in the balance of regulatory interactions.     

rhTPO在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性分析

目的：探讨人促血小板生成素(human thromlbopoietin，hTPO)在大肠杆菌中表达、分离纯化及生物学活性初步鉴定。方法：利用RT-PCR法从人胎肝细胞中扩增目的基因片段，将其定向插入pQE30表达质粒T5启动子下游的多克隆区，转化大肠杆菌M15，得到pQE30-TPO的工程菌，诱导目的蛋白表达、纯化。将表达产物给血小板减少模型小鼠尾静脉注射，观察注射后不同时间血小板量的改变。结果：经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside IPTG)诱导培养，该工程菌可以产生单一特异性的高表达蛋白条带。将纯化后的表达蛋白注射小鼠，结果显示对实验性小鼠血小板减少症具有一定的治疗作用。结论：在大肠杆菌中成功地高效表达了重组hTPO，该产物具有促血小板生成的活性。     

B组轮状病毒WH-2株vp7基因的原核表达与抗体的制备

目的：在大肠杆菌中表达人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白并制备其兔抗血清。方法：根据B组轮状病毒（GBRV）WH-2株vp7基因的全序列设计引物,用PCR的方法扩增得到vp7基因的编码区。将其克隆到原核GST融合表达载体pGEX-KG内,转化大肠杆菌E.coliDH5α,IPTG诱导表达人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白,经SDS-PAGE分离纯化表达的蛋白免疫新西兰兔,制备人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白抗血清。结果：经鉴定确认,vp7基因以正确的方式插入到载体中,此重组表达载体经IPTG诱导后,可表达相对分子量为53.4 kDa的GST-VP7融合蛋白。制备的抗血清经同样诱导表达的表达载体pGEX-KG表达产物吸收后1：500倍稀释后用Western Blot分析,与53.4 kDa的GST-VP7融合蛋白获得特异性显色信号。结论：人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白成功在大肠杆菌中GST融合表达,所表达的蛋白和制备的抗体不但为研究结构与功能提供了物质基础,也为GBRV所引起的疾病预防、诊断和治疗等流行病学研究和临床诊断奠定了基础,具有重要实际应用价值。     

胃癌组织中KAI1、nm23及P53的表达及其临床意义

目的:探讨正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及癌组织中KAI1、nm23及P53蛋白的表达．方法:应用SP法免疫组化检测22例正常胃黏膜,65例不典型增生胃黏膜及74N胃癌组织中的KAI1、nm23及P53蛋白的表达．结果:正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜及胃癌组织中,KAI1和nm23阳性率呈降低趋势,组间差异性有统计学意义(x2=20．885, P<0．001;x2=29．133,P<0．05):P53蛋白阳性表达率呈增加趋势,组间差异性有统计学意义(x2=21．954,P<0．001)．Fisher精确概率检验显示:在胃癌组中不同的浸润深度、有无淋巴结转移和脉管侵犯组内KAI1、nm23及 P53组阳性表达率的差异性有统计学意义(x2 =20．885,P<0．001;x2=29．133,P<0．05;x2= 21．954,P<0．001);而在年龄、性别组间的差异性无统计学意义．Spearman等级相关分析显示 KAI1与nm23表达呈正相关(r=0．859,P<0．05); KAI1与P53表达呈负相关(r=-0．859,P<0．05), nm23与P53表达呈负相关(r=-0．874,P<0．05) 结论:抑癌基因KAI1与nm23的缺失以及P53 蛋白的过表达可能是胃癌发生、发展及浸润和转移的重要原因之一．     

精神分裂症患者G72基因表达水平的研究

目的 本工作旨在检测精神分裂症（Schizophrenia）患者外周淋巴细胞中G72基因的表达情况，进而探讨G72基因的表达与精神分裂症的相关关系。 方法 工作在56例精神分裂症患者和84名年龄性别相匹配的对照中进行，在新鲜外周血样本中抽提总RNA，反转录成cDNA，基因表达量的检测在ABI Prism7900HT型序列监测系统上进行，采用TaqMan的方法对患者及对照组样本的mRNA进行定量，采集的荧光数据经SDS2.1软件自动处理，每个样本作三次平行检测，取平均值作为该样本的最终定量。数据应用SPSS统计软件进行处理，对组间基因表达水平的差异采用独立样本的T检验，调用本实验室G72基因单核苷酸多态性（SNPs）资料，用单因素方差分析的方法分析SNP与基因表达水平的关联性。结果 1.检测得到G72基因在对照组中的表达量为0.0586±0.0114amol/ng cDNA, 在精神分裂症患者组中的表达量为0.0498±0.0121amol/ng cDNA。2.经显著性检验， G72基因的表达水平在病例和对照组间差异无统计学意义，t=-0.512，df138，P=0.609，95%CI:-4.258~2.506。3.单因素方差分析结果显示，rs947267位置上的SNP与该基因的表达水平无相关，F=0.355，df2，χ2=0.703；而rs2181953位置上的SNP与G72基因表达水平相关联，F=6.275，df2，χ2=0.004。A/A基因型的患者基因表达水平显著高于其他基因型。结论：精神分裂症患者G72基因的表达量总体上较正常人并无显著变化，但rs2181953位置上的基因型会影响精神分裂症患者该基因的表达。     

CLONING AND EXPRESSION OF cDNA FOR HUMAN LYMPHO-TOXIN

人淋巴毒素（ｈＬＴ）系由淋巴细胞经抗原或有丝分裂原活化后产生的一类细胞因子，它具有抗瘤、抗病毒活性和许多重要的免疫调节作用，是一种非常有前途的生物制剂。近年来发现的膜相关型淋巴毒素更提示ｈＬＴ可能具有尚未被揭示的免疫调节活性。因此，克隆人ＬＴｃＤＮＡ并在大肠杆菌表达重组ｈＬＴ，对于ｈＬＴ的开发利用和研究其功能都具有重要意义。本实验按照公布的ｈＬＴｃＤＮＡ序列，经计算机分析并结合实验要求设计并合成一对ＰＣＲ引物，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＰＨＡ／ＰＭＡ活化２４ｈ的人Ｔ细胞系Ｊｕｒｋａｔ细胞总ＲＮＡ扩增出一５４１ｂｐＤＮＡ片段；经α－互补筛选，质粒小量快速抽提，限制性内切酶酶切鉴定，将该片段定向克隆于ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９质粒载体。限制性内切酶图谱分析和Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法序列测定表明：该ＤＮＡ片段与公布的人淋巴毒素ｃＤＮＡ序列完全一致。它包括编码人淋巴毒素成熟肽的全部ｃＤＮＡ序列。再进一步将该ｃＤＮＡ片段克隆于原核表达载体ｐＢＶ２２０，经地高辛标记探针菌落原位杂交筛选，限制性内切酶酶切鉴定方向，筛选出一阳性重组子ｐＢＶ－ｈＬＴ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析表明：经温控诱导，该重组菌成功     

Transformation of Trichoderma viride using the Neurospora crassa pyr4 gene and its use in the expression of a Taka-amylase A gene from Aspergillus oryzae

Summary A pyrG mutant of Trichoderma viride, a very efficient cellulase producer, was isolated from among 5-fluoroorotic acid-resistant mutants. The mutation was complemented with the pyr4 gene of Neurospora crassa and used as a selection marker for the transformation of T. viride. A plasmid vector, pDJB1-Taa, carrying both the pyr4 gene and a gene encoding Taka-amylase A from Aspergillus oryzae, was constructed and introduced into protoplasts of T. viride pyrG^-. The transformation frequency was 1–10 transformants (3 on average) per g DNA. One transformant showed highly elevated -amylase production (about 17 times higher than the recipient level) and the integration of more than one copy of the Taka-amylase gene.     

B族链球菌C5a肽酶蛋白表位的克隆、表达和免疫学分析

目的应用生物信息学方法预测B族链球菌C5a肽酶蛋白表位，结合基因工程手段进行表位重组、表达和免疫原性分析。方法用预测程序ProPred和ANTIGENIC预测B族链球菌C5a肽酶蛋白的表位，应用PCR技术扩增出编码该表位基因片段，克隆PCR产物构建重组质粒，测序验证。在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达融合蛋白。表达的蛋白经质谱分析和Western blot鉴定。纯化该融合蛋白并免疫C57／BL小鼠，萃取GBS表面蛋白，双向琼脂扩散试验检测抗体水平。结果在SCPB中预测到1个既具有MHC结合肽特性又具有B细胞表位特征的肽段。重组和表达了这一肽段，质谱得出与SCPB蛋白的相似性分数为79，Western-blot证实能与抗SCPB的抗体反应，纯化后融合蛋白纯度〉90％。动物实验证实融合蛋白能产生特异性的抗GBS抗体。结论重组表位具有一定免疫原性。为相关蛋白的毒力机制研究和亚单位疫苗等方面的研究打下了良好的基础。     

人类白细胞抗原-G突变体cDNA克隆及在K562细胞上的表达

目的：克隆人类白细胞抗原-G(Human leukocyte antligen-G，HLA-G)突变体cDNA，并使其在HLA-I类阴性的K562细胞上获得稳定表达，为研究配-受体之间的识别机制奠定基础。方法：用RT-PCR方法从人子宫蜕膜组织扩增出HLA-GcDNA，得到全长HLA-GPCR产物后，用桥式PCR方法进行定点点突变，将突变的目的基因亚克隆于逆转录，将突变的目的基因亚克隆于逆转录mG-pLNCX表达载体，采用感染的方法将重组质粒转入K562细胞，最后经G418筛选及有限稀释，利用单克隆抗体W6/32进行FACS及mRNA检测，观察HLA-G突变体在靶细胞表面的表达。结果：HLA-G突变体分子在经mG-pLNCX转染的靶细胞表面获得稳定高表达。结论：成功构建了mG-pLNCX表达载体，并使HLA-G突变体分子在HLA-I类阴性的靶细胞K562细胞上获得稳定表达。