布病胶体金免疫层析检测方法的建立

目的建立诊断布病的胶体金免疫层析方法。方法以B.abortus 544A全菌免疫BALB/c小鼠,以杂交瘤细胞技术制备单抗,纯化后以胶体金标记,选择最佳反应模式组装试纸条,并对其进行鉴定。结果已筛选4B8、1G9、1C9和1E24株稳定分泌单抗的细胞株,以其单抗互相配对组合的试纸条均能检出B.abortus 544A菌。其中以1G9为包被抗体、4B8为金标抗体的试纸检测效果最佳,与以B.abortus 544A菌多抗为包被抗体、4B8单抗为金标抗体的试纸对比,检测结果一致,且不与其他菌发生交叉反应。对PCR检测为阳性的70份牛血清样品,两种试纸条检测结果的符合率均为100%。结论所建立的诊断布病的胶体金免疫层析法快速、简便、准确,有望用于布病的诊断。     

HPV16型免疫胶体金诊断试纸条的制备

建立一种快速、准确、简便检测高危型人乳头瘤病毒16型的胶体金诊断试纸条,以用于宫颈癌的早期筛查。用柠檬酸三钠还原法制备了酒红色的30 nm胶体金颗粒,胶体金颗粒标记的单抗的实际标记量为6μg/mL。选用了2种稳定剂BSA和PEG20000获得了稳定的金标抗体溶液。实验结果表明:第7种样品垫处理液和第7种结合垫处理液处理样品垫和结合垫组装的试纸条效果最好;试纸条检测HPV16E6蛋白为阳性,检测HPV16L1蛋白为阴性。     

人血清淀粉样蛋白A1原核表达及胶体金检测方法的建立

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的SAA1定量检测新方法.利用大肠杆菌BL21(DE3)原核表达人血清淀粉样蛋白A1(SAA1),根据BL21(DE3)表达偏好性设计并合成SAA1蛋白基因片段,构建表达载体pET-28a-SAA1,采用CaCl2法制备BL21(DE3)感受态,热激转化法将pET-28a-SAA1转入到BL21(DE3).经表达条件优化,获得重组蛋白最佳诱导表达条件:温度30℃,时间6h,转速180rpm/min,培养基pH 7.0,IPTG浓度0.4mM,诱导表达后目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定,Ni柱纯化、透析、浓缩从而获得浓度为8.09mg/ml,纯度为85%的SAA1.同时,结合胶体金标记技术,建立了SAA1胶体金免疫层析试纸检测方法,线性范围0.16~500μg/ml,最低检测限0.16μg/ml,该研究为临床体外诊断SAA1快速检测提供技术基础.     

pH值对胶体金制备的影响

研究了不同的溶液pH值对胶体金颜色、粒径的影响。在不同pH值下通过柠檬酸三钠法制备胶体金溶液,利用紫外/可见光吸收分光光度计对胶体金进行扫描,得到最大吸收峰波长及峰宽;通过透射电镜观察其颗粒直径及分布,再将二者结果进行比较分析。结果显示:随着溶液pH值变小,胶体金颜色由红→蓝→黑,粒径变大。     

甲基苯丙胺免疫层析测试条的研制

采用枸橼酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒，标记甲基苯丙胺单克隆抗体，制成免疫层析测试条，建立了一种简易快速、自测式胶体金免疫层析法，并用于尿液中甲基苯丙胺的检测。尿液中的甲基苯丙胺与测试条上金标记抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动，与膜上的固相二抗或抗原结合，根据是否出现肉眼可见的红色线条判断人体尿液中是否含有甲基苯丙胺。结果显示，甲基苯丙胺免疫层析测试条只与甲基苯丙胺发生特异性反应，符合中国药品生物制品检定所制定的检测甲基苯丙胺标准品的标准，灵敏度为1000μg／L，与典型的麻醉药物和镇静药物无交叉反应。甲基苯丙胺免疫层析测试条检测尿液中的甲基苯丙胺具有特异性强、灵敏度高、结果显示清楚、快速、简便、省时、实用等特点。     

鞣酸还原法制备胶体金及其蛋白标记研究

本文采用单纯鞣酸还原法和传统柠檬酸三钠法分别制备了40nm胶体金,并用它们进行氨苄青霉素全抗原标记实验;通过光谱扫描、纳米粒度仪检测等多种方法对两种胶体金进行蛋白标记前后的质量对比鉴定,通过抑菌试验进一步验证蛋白标记成功,同时用考马斯亮蓝G-250法定量检测蛋白标记量。结果显示:单纯鞣酸还原法制备的胶体金粒径均匀度比传统柠檬酸钠法更佳,可在常温下进行,比需加热的传统柠檬酸钠法操作更加简单易行;鞣酸法胶体金通过加入K2CO3调节pH后进行蛋白标记,标记量为6.8μg/mL,略低于柠檬酸钠法胶体金的8.3μg/mL,胶体金标记前后的光谱曲线及粒度分布图均发生了相应变化,标记物抑菌效果明显。     

自组装法合成金磁微粒及其表征测定

利用化学共沉淀法合成磁性Fe3O4微粒,使用硅烷化试剂APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)在乙醇分散的Fe3O4微粒表面进行氨基化修饰,并通过酸碱滴定法测得氨基化Fe3O4微粒表面的氨基含量为0.15mmol/g。采用Frens法合成粒径在20nm左右的纳米级胶体金,进一步利用Au-N键将金纳米微粒组装到Fe3O4微粒表面。可见光吸收光谱分析表明金磁微粒在520nm-550nm处表现出由于Au存在而产生的特征吸收峰,同时原子吸收光谱分析也获得金磁微粒的Fe3O4:Au元素构成比例为1:0.97。     

市售甲氧苄啶快检试剂盒绝对灵敏度的分析

为了解导致市售甲氧苄啶快检试剂盒产品实际检测灵敏度不够的原因,本研究对检出限符合要求且适用于动物源性食品中甲氧苄啶检测的胶体金快检产品进行绝对灵敏度研究。结果显示,试剂盒的绝对灵敏度和实际检测灵敏度不成正比。因此,有必要进行甲氧苄啶快检方法研究,提高试剂盒产品实际检测灵敏度,并进一步优化试剂盒产品中胶体金标记的抗原抗体,提高产品对0.5倍检测限和1倍检测限的识别差异,以提高快检准确度,确保试剂盒产品的快检监管效果。     

商品化甲氧苄啶胶体金快检试剂盒检测效果评价与分析

为了解商品化甲氧苄啶胶体金快检试剂盒对动物源性食品的快检效果,探讨目前动物源性食品中甲氧苄啶快速检测方法存在的问题,确定下一步的研究方向。本文通过对国内快检产品生产企业技术实力的资格审查,择优筛选出5个品牌试剂盒进行质量评价,并对相对准确度较高的3个品牌试剂盒产品进行绝对灵敏度研究。质量评价结果显示,5个品牌试剂盒产品的假阴性率在9.1%～25.0%,均不符合假阴性率应≤5%的考察要求,其中3个品牌产品假阴性率在20%左右,漏检风险较高。因此,有必要进行甲氧苄啶快检方法研究,提高试剂盒产品实际检测灵敏度,确保试剂盒产品的快检监管效果。     

AFP免疫层析测试条的研制

以复合型层析材料为固相,用胶体金标记ＡＦＰ ＭｃＡｂ Ａ１４Ｃ１１,ＡＦＰ ＭｃＡｂ Ａ４Ａ１４包被于固相,采用双抗体夹心免疫层析技术,研制出ＡＦＰ免疫层析测试条。该方法敏感度为１０μｇ／Ｌ,结果显示清楚,具有简易、快速、灵敏、实用、省时等特点。