标记免疫测定技术的研究进展

近年来检验医学迅速发展,临床实验室使用的免疫测定技术也日新月异。作为临床免疫测定技术的一个重要分支——标记免疫测定技术是最为活跃的,也是发展最快的,其基本原理是利用抗原抗体反应的高度特异性,加上各种标记物的可测量性来达到方便敏感地检测体内各种微量生物活性物质的目的。     

一种血浆肿瘤型M2-丙酮酸激酶检测方法——酶联免疫吸附试验的临床评价

目的评价一种血浆肿瘤型M2-丙酮酸激酶（TUM2-PK）检测方法——酶联免疫吸附试验（ELISA）的测定性能和临床适用性。方法对新的自主开发的TU M2-PK检测方法进行偏倚测定、不精密度测定、回收试验以及对371例临床标本进行测定。结果TU M2-PK检测方法有良好的准确度（偏倚〈5 U/mL）和精密度[变异系数（CV）〈10%]。371份临床标本的TUM2-PK水平测定结果与＂金标准＂病理结果对照,TUM2-PK的敏感性和特异性分别为69.7%（106/152）和86.8%（190/219）,准确度达到80.0%（296/371）。此外,该试剂盒所测得的恶性肿瘤患者的TU M2-PK水平明显高于良性肿瘤患者及正常对照者,差异具有统计学意义（P均〈0.01）。结论TU M2-PK ELISA测定性能良好,具有较好的临床应用价值。     

梅毒螺旋体特异性抗体检测方法在血清学诊断中的应用评估

目的对临床上常用的2种梅毒螺旋体(TP)特异性抗体检测方法进行评价。方法收集350份术前筛查样本,以梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)检测结果分组(第1组125份样本,为TPPA有反应性;第2组25份样本,为TPPA 1∶80弱反应性;第3组200份样本,为TPPA阴性),采用免疫层析法和化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)平行检测3组样本,结果不一致的样本采用免疫印迹法复核。结果第1组和第2组150份样本中,免疫层析法检出有反应性样本145份,5份未检出,敏感性为96.7%(145/150);CMIA检出有反应性样本150份,敏感性为100.0%(150/150),2种方法的敏感性差异无统计学意义(P0.05)。第3组200份样本中,免疫层析法检出弱反应性样本8份,CMIA检出有反应性样本16份。免疫层析法与TPPA有13份样本的检测结果不一致,2种方法的一致率为96.3%(337/350);CMIA与TPPA有16份样本的检测结果不一致,2种方法的一致率为95.4%(334/350);免疫层析法的特异性为98.5%(192/195),CMIA的特异性为94.4%(184/195),2种方法的特异性差异无统计学意义(P0.05)。结论免疫层析法和CMIA均具有很好的敏感性和特异性,且与TPPA一致性较好,可用于临床检测。     

人附睾蛋白4基因表达下调对卵巢癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨人附睾蛋白4(HE4)基因表达下调对卵巢癌细胞增殖、黏附以及侵袭能力的影响.方法 构建含HE4 shDNA的重组质粒,并将其转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,RNA干扰后,通过即时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western blot等测定HE4表达下调情况;同时利用平板克隆形成实验、细胞黏附实验、测定稳定转染细胞的侵袭力改变等方法,比较分析HE4相关的生物学效应.结果 Western blot以及qRT-PCR结果均提示HE4干扰重组质粒构建成功,稳定转染SKOV3细胞后能显著抑制HE4基因的表达.体外实验显示,HE4表达下调的细胞侵袭能力明显下降(P＜0.05),黏附率明显下降到27.3％,而增殖能力较转染前无明显变化.结论 所构建的HE4干扰重组表达载体能有效抑制HE4基因表达,而HE4表达下调对卵巢癌的细胞黏附和侵袭能力降低.     

沉默信息调节因子过表达或谷氨酰胺剥夺对肾透明细胞癌细胞凋亡、增殖的影响

背景与目的：肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）是最常见的肾癌类型,它与代谢密切相关。探讨沉默信息调节因子4（silent information regulator 4,SIRT4）过表达或谷氨酰胺（glutamine,Gln）剥夺对ccRCC细胞增殖、凋亡的影响。方法：慢病毒构建SIRT4和突变体H161Y过表达的Caki-2细胞株,利用无Gln的培养基来构建Gln剥夺模型,并通过体外增殖活力实验［细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）］和克隆形成实验来分析两者对Caki-2细胞增殖和生长能力的影响;利用DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）水平进而评估Gln代谢对细胞ROS含量的影响;进一步通过线粒体膜电位检测、凋亡检测和蛋白质印迹法（Western blot）检测凋亡相关分子,分析SIRT4过表达以及Gln剥夺对Caki-2细胞凋亡的影响。结果：过表达SIRT4可抑制Gln代谢从而抑制Caki-2细胞增殖,另外还原性物质还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phostate,NADPH）的生成减少能够增加细胞内ROS含量,促进细胞凋亡。而Gln剥夺抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的效果均比过表达SIRT4明显,但长期缺乏Gln将导致细胞无法生长。结论：无论是过表达SIRT4还是Gln剥夺均能抑制ccRCC细胞增殖,促进凋亡。     

联合检测甲胎蛋白和癌胚抗原的胶体金免疫层析试剂的研制及性能评价

目的 建立一种新型的联合检测甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的胶体金免疫层析法(GICA).方法 G4和C2为一对抗AFP单克隆抗体(McAb),A1和C9为另一对抗CEA McAb,G4和A1分别以直线形式平行包被于固相硝酸纤维素(NC)膜上,C2和C9分别与胶体金结合后固定于结合物垫,制备成GICA试剂条.膜上另包被2 mg/mL兔抗鼠IgG抗体,用于检测有效性.结果 利用双抗体夹心原理,建立了可同时检测血清中AFP和CEA的GICA.本法经AFP和CEA标准液测定,试剂的敏感性为AFP (30 μg/L)、CEA (10 μg/L),与血红蛋白、人白蛋白、人球蛋白等无交叉反应,稳定性试验表明试剂可以在室温保存6个月以上.86份经化学发光免疫分析仪定量测定AFP、CEA浓度的临床血清标本用于本法的对比测定,符合性良好.结论 联合检测AFP和CEA的GICA试剂具有结果 可靠、方法 简便、快速等优点,与化学发光法测定结果 符合性良好.     

载脂蛋白E：老年痴呆患者基因多态性的研究

人类载脂蛋白E（ApoE)基因具有多态性,存在着三种常见的等位基因（ε2,ε3,ε4）,它们分别编码三种异构体（E2,E3,E4）,三种异构体的区别在于彼此之间的单个氨基酸的替换,ApoE多态性是老年痴呆（Alzheimer‘s disease,AD)疾病危险性的重要决定因子,携带ε4等位基因患此类疾病普遍增多,ApoE基因型检测可望为临床提供有意义的实验诊断信息,ApoE基因型检测方法需要引入临床实验室,而方法的选择应依据检查的需要,其中毛细管凝胶电泳（CGE）又是较为先进的检测方法之一,很具吸引力。     

MR-1S融合蛋白的表达、纯化与保存及其抗血清的制备

目的通过人肌纤生成调节因子1(hMR-1S)基因重组表达获得MR-1S-His融合蛋白,纯化后制备抗MR-1S抗血清;同时确定该蛋白保存的稳定体系,为研究MR-1S蛋白理化性质及其功能提供关键的原料。方法利用原核表达载体pET21a(+),构建pET21a-MR-1S重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导MR-1S-His融合蛋白表达,亲和纯化后Western blot鉴定;进一步用该融合蛋白免疫新西兰兔,制备抗MR-1S的多克隆抗体。同时通过在不同温度条件下,对4种不同的稳定体系中保存后蛋白活性测定进行比较,确定最合适的稳定保存体系及条件。结果构建了重组质粒pET21a-MR-1S,并在BL21中进行可溶性表达,经Western blot鉴定确认;免疫新西兰兔获得了抗MR-1S抗血清;确定了合适的稳定体系及保存条件。结论在非变性条件下实现了可溶性MR-1S融合蛋白的表达和稳定保存,进一步制备的抗MR-1S抗血清为研究MR-1S的性质及功能奠定了基础。     

血浆氧化型低密度脂蛋白检测在肾细胞癌诊治中的临床意义

[目的]评估血浆氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)检测在肾细胞癌诊疗中的临床意义.[方法]使用ELISA方法测定血浆ox-LDL浓度,研究对象包括84例来自复旦大学附属肿瘤医院的肾细胞癌患者以及对照人群(40名体检健康者).[结果]肾细胞癌组血浆ox-LDL含量为9.28(7.93,10.93)ng/ml,显著性高于健康人群血浆ox-LDL含量7.23(6.43,8.00) ng/ml (P＜0.05).肾细胞癌患者手术治疗后血浆ox-LDL水平较术前有所下降.血浆ox-LDL与肿瘤大小相关;而恶性程度高的患者血浆ox-LDL较高.[结论]肾细胞癌患者血浆ox-LDL水平较健康者高,且ox-LDL水平与肿瘤大小和恶性程度密切相关.     

Alzheimer‘s disease患者载脂蛋白E多态性的检测

人类ＡｐｏＥ基因型存在多态性,这种多态性是老年性痴呆发病的易和危险因子之一,可为临床诊断提供重要的实验指标和信息。方法,本文采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技术,Ｈｈａｌ酶切ＰＣＲ扩增产物后的片段经１０％ＰＡＧ电泳和４％琼脂糖电泳,分析了ＡｐｏＥ基因型。在此基础上,我们分析了４０名ＡＤ患者和３５名正常对照者。结果实验显示：ＡＤ组和正常对照组的ＡｐｏＥ基因型有显著的差异,且ＡＤ组中ε４等位基因明显高于对照组,分