小麦花粉离体萌发培养体系的筛选

为了准确检测小麦花粉活性,以5个常规小麦品种为材料,4种花粉离体萌发培养体系为候选方法,通过比较不同体系花粉萌发率差异,从而找到最佳的小麦花粉离体萌发培养体系。结果表明：小麦成熟花粉在20%蔗糖+10%PEG4000+40mg/LH3BO3+3×10-3mol/LCa(NO3)2+10mg/LVB1中28℃培养30min,通过镜检观察,可诱导萌发频率高达90%以上。同时,经过K型小麦不育系、保持系和F1材料的鉴定,表明上述培养基适合于小麦花粉离体萌发,能够准确检测小麦花粉活性。     

杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育大田生产制种技术的研究

研究了在杂交小麦大田制种条件下,花期调节剂对以SQ-1杀雄剂诱导的小麦雄性不育母本异交结实率的作用;同时还比较了父本盛花期采用机动授粉器进行人工辅助授粉的基础上,父母本不同行比下的母本异交结实率.结果表明,花期调节剂对提高杂交小麦大田制种母本的异交结实率有极显著的效果;父本盛花期采用机动授粉器进行人工辅助授粉的条件下,父母本8∶8行比可以有足够的花粉供应,适合大田小麦杂交制种,应加以推广与应用.     

小麦转录因子TaMYB5 like转录自激活能力及其参与生理型花粉败育过程表达模式研究

化学杂交剂SQ-1诱导的小麦花粉败育是一个复杂的生理代谢过程,TaMYB5-like被发现参与此过程。为了解TaMYB5-like基因在SQ-1诱导小麦生理型花粉败育过程中的作用,以SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育系PHYMS-1376和对照可育系CK-1376四分体、单核早期、单核晚期、二核期和三核期花药为试验材料,克隆TaMYB5-like基因,并对其进行序列结构、生物信息学、表达模式、亚细胞定位及转录自激活效应分析。结果发现,TaMYB5-like基因序列长5 207 bp,其cDNA长为1 133 bp,其中CDS序列长819 bp,编码272个氨基酸,含有2个SANT结构域,分子量为29.36 kDa,无信号肽,无跨膜结构,亚细胞定位在细胞核内;TaMYB5-like基因启动子涉及光响应、逆境胁迫响应、茉莉酸甲酯响应等顺式作用元件。自激活效应发现,TaMYB5-like蛋白的自激活区段位于N端,合适浓度的AbA和3-AT可以抑制BD-TaMYB5-like和BD-TaMYB5-like-N-SANT融合蛋白的自激活性;随着蛋白质氨基酸序列的截断,自激活性呈降低趋势。与CK-1376相比,PHYMS-1376四分体和单核早期花药中TaMYB5-like表达量差异不显著;花药发育到单核晚期、二核期和三核期时,TaMYB5-like表达量显著增加;CK-1376和PHYMS-1376三核期时花药内TaMYB5-like表达量均最高。     

耐低钾山羊草基因型的筛选与鉴定

为研究小麦近缘属种的耐低钾特性,分析不同山羊草(Aegilops)耐低钾胁迫下各生理指标的差异,筛选和鉴定耐低钾基因型。本试验通过砂培法,以9种不同基因型山羊草为供试材料,采用改进的Hoagland营养液,设低钾(0.02mmol·L~(-1) KCl)和正常供钾(2.0mmol·L~(-1) KCl)两个水平进行试验。对相对根冠比、相对根长、相对地上部干重、相对钾积累量和相对钾利用效率5个指标进行相关分析和主成分分析,筛选出3个综合指标进行山羊草耐低钾基因型的鉴定。结果发现,不同基因型山羊草对低钾胁迫存在显著的差异。地上部干重、钾积累量和钾利用效率可以作为苗期耐低钾种质筛选的重要指标。综合评价结果表明:双角山羊草(Ae.bicornis)、偏凸山羊草(Ae.ventricosa)、粗厚山羊草(Ae.crassa)、拟斯卑尔托山羊草(Ae.speltoides)、尾状山羊草(Ae.caudata)、粘果山羊草(Ae.kotschyi)、易变山羊草(Ae.variabilis)、欧山羊草(Ae.biuncialis)、小伞山羊草(Ae.umbellulata)的综合评价值(D值)分别为0.383,0.898,0.327,0.516,0.007,0.682,0.338,0.346,0.655。由此可知,其中偏凸山羊草耐低钾胁迫能力最强,其次是粘果山羊草,尾状山羊草耐低钾胁迫能力最弱。通过本试验,初步建立了山羊草耐低钾种质的评价指标,为进一步研究山羊草的耐低钾分子机制,以及小麦育种上利用耐低钾山羊草种质提供了材料和理论依据。     

小麦 TaWRKY51基因的克隆及其参与SQ-1诱导小麦花粉败育过程的表达模式研究

为进一步深入解析化学杂交剂SQ-1诱导小麦花粉败育的机理,本研究从SQ-1诱导的生理型雄性不育系PHYMS-1376及其对照可育系CK-1376各时期花药转录组测序筛选出差异表达基因TraesCS1D02G362900.1,与小麦基因组数据库比对发现,该基因编码的氨基酸与 TaWRKY51同源度为97%,说明该差异表达基因为 TaWRKY51对其进行生物信息学分析、亚细胞定位、转录激活活性与花药表达模式研究,结果表明, TaWRKY51开放阅读框全长663 bp,可编码220个氨基酸,含有WRKY结构域和锌指结构,分子量约为23.34 kD,等电点为6.42;启动子区包含与光响应、茉莉酸甲酯响应、脱落酸响应等7类顺式作用元件,且TaWRKY51蛋白被定位在细胞核内,具有一定的转录激活活性;与CK-1376相比,PHYMS-1376植株花药中 TaWRKY51的表达量在5个发育时期均高于CK-1376,且在四分体时期、单核晚期、二核期和三核期与CK-1376的差异均达极显著水平,表明该基因与PHYMS-1376花粉败育密切相关。     

小麦雄性不育系绒毡层异常代谢与小孢子败育的关系

【目的】研究小麦遗传型雄性不育系花药绒毡层降解及营养物质代谢,并揭示其与花粉败育的关系。【方法】以小麦S型1376不育系[(S)-1376(A)]及其保持系[(A)-1376(B)]为试材,在三核期分别用DAPI和KI-I2对花粉粒内淀粉积累进行染色观察;采用半薄切片技术对不育系(S)-1376和保持系1376绒毡层发育过程及多糖、脂类和蛋白等物质积累进行观察和比较;采用软件cellSens Entry和IPP 6.0分别计算图片中小孢子和绒毡层细胞的面积及分析各发育时期图像中的平均光密度值。【结果】与保持系1376比较,(S)-1376花粉粒被KI-I2染成浅黄色,表明三核期其花粉中无淀粉积累,花粉败育彻底;不育系(S)-1376绒毡层较保持系1376绒毡层细胞提前至四分体时期启动细胞程序化死亡（PCD）过程;不育系(S)-1376花粉核发育迟缓,大多发育至单核晚期停止分裂,仅少数可发育至二核期;(S)-1376小孢子在四分体时期和单核早期显著增大;绒毡层细胞在四分体时期也显著大于保持系1376绒毡层细胞。在(S)-1376花粉的发育过程中,除四分体时期外,其余各时期多糖含量（呈红色）均低于保持系对应的各发育时期,不育系(S)-1376绒毡层中多糖在四分体时期多于保持系,在单核早期显著降低。在花粉整个发育过程中,不育系(S)-1376花粉中被染成黑色脂类的含量明显低于保持系,不育系绒毡层中的脂类含量在各个时期也低于保持系。不育系(S)-1376小孢子母细胞四分体时期被染成蓝色的蛋白含量很高,但单核晚期显著降低;在绒毡层细胞中单核早期蛋白含量显著低于保持系,这可能暗示该时期保持系绒毡层开始启动降解。在花粉发育整个过程中保持系1376小孢子母细胞中四分体时期多糖和蛋白的含量都低于不育系(S)-1376,这可能与该时期不育系绒毡层提前降解需要大量的多糖和蛋白有关;单核晚期小孢子中的多糖、脂类和蛋白含量高于不育系,该时期是正常小孢子发育的关键时期,不育系中各种物质供应不足可能是导致花粉败育的主要原因。在二核期和三核期,不育系(S)-1376花粉营养细胞中大液泡不消失,细胞质内含物也不持续增加,淀粉粒、脂类等物质积累终止,最终导致小孢子内没有内含物的积累,呈空壳晶体状。【结论】小麦S型1376A不育系花药绒毡层提前降解所诱发的物质异常代谢,使小孢子在由单核晚期向二核期发育的过程中物质供应不足导致细胞核分裂异常,最终引起花粉败育。     

利用药物印迹法筛选化学杂交剂苯哒嗪靶标蛋白基因

为了筛选化学杂交剂苯哒嗪的靶标蛋白基因,以SQ-1(15%苯哒嗪乳油)处理的小麦品种西农1376为材料,以噬菌体λTripl Ex2为载体,利用SMART技术构建小麦单核期花药c DNA表达文库;以生物素为报告基团,合成苯哒嗪小分子探针,并利用该探针在c DNA表达文库中进行苯哒嗪靶标蛋白基因筛选。结果成功构建了一种新型有效的药物印迹筛选方法,获得了一条能够与苯哒嗪结合的蛋白基因c DNA序列,其编码蛋白属于DUF3456家族。研究结果为进一步明确SQ-1(有效成分苯哒嗪)的作用机理提供了依据。     

大穗材料高麦1号/ 密小穗F2群体穗长性状的QTL初步定

为了解小麦穗长性状的遗传特性,并将其应用于分子标记辅助育种,以大穗材料高麦1号/密小穗的292个植株的F2群体为材料,利用SSR标记对穗长进行了QTL定位分析.结果表明,选用500对SSR引物对高麦1号和密小穗两个亲本进行多态性检测,共获得180对在双亲问有多态性的引物,多态性引物检出率为36.0％.利用这180对引物进一步进行F2群体筛选,有96对引物在群体中表现出多态性,占多态性标记的53.3％.利用QTL_IciMapping软件构建出小麦染色体组的8个连锁群图谱,并将96对SSR引物定位到遗传连锁图谱上.图谱全长1 383.29 cM,标记间的平均遗传距离15.37 cM.平均每个连锁群有11.25个标记,含有标记最多的是4A和6B染色体,各有17个标记,其次是3A和7B染色体,含有9～14个标记,1B和5D染色体含有的标记最少,只有5～7个.共检测出7个与穗长相关的QTL位点,包括6个加性QTL和1个加性+显性QTL.7个QTL的加性效应值均为正值,单个QTL的贡献率为2.04％～15.26％.其中3A染色体上的QTL位点距离其最近标记只有0.58 cM,为连锁最紧密的一个位点,并且其加性效应值最大,可解释表型变异的15.26％.因此,3A染色体上存在控制穗长的主效基因.     

小麦花粉育性检测和花粉致死基因携带种质的鉴定

小麦雄性不育主要是通过花粉的败育来表现,研究花粉致死基因对小麦杂种优势的利用研究具有重要意义和价值。本研究通过对组配的155个F1杂交组合成熟花药用1%KI-I2染色,显微镜观察,鉴定花粉败育情况,并对表现出花粉半不育特性的F1组合亲本进行花粉致死基因的鉴定。结果表明,在155个冬小麦F1杂交组合中有4个F1组合(西农9718/鑫农516,西农9817/周麦22,西农9817/西农509,西农261/西纯4号)的花粉表现为半不育花粉状态,一半花粉粒碘染呈深蓝色圆形,花粉粒较大;另外一半的花粉粒较小,不规则,未上色。用中国春(具有显性花粉致死基因Ki)和宁春4、宁春16小麦品种(具有隐性花粉致死基因ki)与4个F1组合亲本分别杂交获得相应F1,对其花粉染色显微镜鉴定,从中筛选出携带相应等位显性Ki基因的品种2份,携带相应等位隐性ki基因的品种4份。     

小麦生理型和遗传型雄性不育系及其保持系小花完整叶绿体蛋白质组分比较研究

采用固相pH梯度SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳技术,以小麦遗传型雄性不育系ms(S)-1376、杀雄剂SQ-1诱导的生理型雄性不育系ms(A)-1376,以及对应的保持系(A)-1376 (杀雄剂诱导前的正常可育系)所构建的等基因和等生理差异系为试材,比较分析了2种分离纯化完整叶绿体的方法。在确立了一套适用的技术方法的基础上,研究了三者在花粉小孢子萌发单核早期小花完整叶绿体蛋白之间的差异。采用30%、45%和60%的不连续蔗糖密度梯度离心的方法能够获得完整且纯度较高的叶绿体,经TCA-丙酮提取蛋白质后,PDQuest软件分析,在分子量14.4~66.2 kD,等电点4~7的线性范围内可分辨出2-DE图谱上239个较为清晰的蛋白质点,对其中的6个差异表达蛋白质点进行MALDI-TOF肽质量指纹图谱分析,从生物信息学数据库检索鉴定出6个差异蛋白质点分别是酰基辅酶A脱氢酶结构域蛋白、钙调结合蛋白磷酸酶、多催化功能肽酶、热休克蛋白60、光受体蛋白2及1个未知功能的表达蛋白质。这些蛋白质在供试小麦叶绿体物质能量代谢、叶绿体防卫抵御机制、叶绿体细胞内信号转导及植物极性生长等生理应答反应中起调控作用,它们能在本研究供试两不育系和对应可育系中差异表达,可能与雄性不育相关。