人胚胎肾小球系膜细胞培养与鉴定

肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells,GMC) 是肾小球内具有活跃功能的固有细胞,多种刺激因素均可使肾小球系膜细胞增生, 构成各种肾小球疾病的病理基础,进而因系膜基质增多而导致肾小球硬化.自1975年Fish等[1]首次成功培养分离GMC以来,国内外学者已将肾小球系膜细胞的体外培养作为研究肾脏细胞生物学及细胞免疫病理学的常用方法之一.由于肾小球系膜细胞培养方法各异[2～4],难度较大.为此,我们在借鉴国内外学者研究方法的基础上进行探索,成功地培养了人胚胎肾小球系膜细胞,现报告如下.     

一氧化氮诱导HL-60细胞凋亡及其机制探讨

目的：观察一氧化氮对人类白血病细胞是否具有致凋亡作用，并研究Bcl-2基因和P53基因在此过程中的作用。方法：将不同浓度的外源性一氧化氮供体亚硝基铁氰化钠与HL-60细胞作用，观察其作用的时间效应和剂量效应；用MTT法观察NO对细胞的抑制作用，用透射电镜观察细胞结构改变，用DNA凝胶电泳、细胞DNA含量、DNA末端标记、Annexin-V/PI法等分析细胞凋亡，并用流式细胞法进一步观察在NO作用过程中凋亡调控因子Bcl-2和P53蛋白及线粒体膜蛋白表达变化。结果：NO能抑制HL-60细胞生长，并在一定的剂量范围内显示作用时间和剂量的量效关系；典型的细胞形态改变、DNA片段化、亚G1峰检出、DNA末端标记、Annexin-V/PT^-表达增加等证实。NO能诱导白血病细胞凋亡；在此过程中，P53蛋白表达上调，而Bcl-2蛋白表达下调，线粒体膜蛋白表达增加。结论：NO对HL-60细胞有强的致凋亡作用，Bcl-2和P53参与NO诱导HL-60细胞凋亡的调控。     

2型糖尿病患者胰岛素原测定的意义

目的了解2型糖尿病患者中胰岛素原(PI)水平的变化.方法对2型糖尿病患者行OGTT试验,分别测定血糖、免疫活性胰岛素(IRI)及PI,并计算PI/IRI值.结果 2型糖尿病患者PI水平在空腹及餐后30、60、120、180min均较对照组升高(均P＜0.01、0.05),PI/IRI值亦明显高于对照组(均P＜0.01和＜0.05).结论在2型糖尿病患者中,测定PI水平(尤其是空腹PI水平及PI/IRI值),可作为一项早期了解2型糖尿病β细胞功能的指标.     

脓毒症患者调节性T细胞与CD64指数的相关性研究

目的 探讨CD4+ CD25+/highCD127low/-、CD14+ HLA-DR+在脓毒症发生发展中的作用.方法 流式细胞术检测脓毒症患者(其中生存组17例,死亡组11例)CD4+ CD25+/highCD127low/-、CD14+ HLA-DR+、CD64指数,同时测定白细胞数(WBC)和C-反应蛋白(CRP)的水平,并与正常对照组比较.结果 脓毒症组CD4+ CD25+/highCD127 low/-、CD64指数均明显高于正常对照组,CD14+ HLA-DR+明显低于正常对照组;动态观察结果显示,随着疾病的进展,生存组CD4+ CD25+highCD127low/-、CD64指数均明显回落,而死亡组两者却持续升高;而CD14+ HLA-DR+刚好相反,生存组CD14+HLA-DR+逐渐升高,死亡组CD14+ HLA-DR+明显低于存活组,且持续处于低水平状态;相关性分析显示,CD4+ CD25+/high CD127low/-与CD64指数、CRP正相关;CD14+ HLA-DR+与CD64指数、CRP明显负相关;CD54指数与WBC、CRP正相关.结论 CD4+CD25+/highCD127low/-、CD14+ HLA-DR+与疾病感染和炎症严重程度密切相关,可作为疾病严重程度及预后的指标.     

四嗪二甲酰胺对慢性B淋巴细胞白血病CD4+CD25+调节性T细胞体外作用的研究

目的研究四嗪二甲酰胺(ZGDHu-1)对慢性B淋巴细胞白血病(chronic B cell lymphocytic leukemia,B-CLL)CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)的影响,初步探讨其对CD4+CD25+Tregs的作用机制。方法 B-CLL外周血淋巴细胞分离培养,流式细胞术检测ZGDHu-1作用前后CD4+CD25+/highCD127low、CD19+CD5+以及CD4+CD25+Tregs细胞活力、细胞凋亡、Fas、FasL、APO2.7及Bcl-2、Bax。结果 B-CLL的CD4+CD25+/highCD127low、CD19+CD5+明显高于正常对照组,且CD4+CD25+/highCD127low与CD19+CD5+明显正相关。ZGDHu-1作用后,B-CLL的CD4+CD25+/highCD127low、CD19+CD5+明显降低,CD4+CD25+Tregs活力明显下降和凋亡明显升高;CD4+CD25-T细胞活力也有一定程度的下降,凋亡升高,但其凋亡明显低于CD4+CD25+Tregs。ZGDHu-1作用后,CD4+CD25+Tregs的APO2.7明显增加,Bcl-2明显降低,Bax没有变化,而CD4+CD25-T细胞FasL明显增加。结论 ZGDHu-1作用后B-CLL的CD4+CD25+Tregs明显下降,可能与Bcl-2/Bax比值降低,APO2.7表达增高,而促进B-CLL CD4+CD25+Tregs的凋亡有关。     

氯沙坦对高血压病人血压、凝血和纤溶活性的影响

目的观察高血压病人凝血和纤溶活性的改变,探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂氯沙坦对高血压病人血压以及凝血和纤溶系统的影响.方法将26例原发性高血压病人和30例正常对照组进行比较.所有入选对象1个月内未服任何降脂药物,停用降压药1周以上,禁食10h后,次晨抽取血样,测定各项指标.结果高血压病人胰岛素敏感性指数(ISI)和组织型纤溶酶原激活物(tPA)水平降低,而纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)活性和血管性血友病因子(vWF)则升高.经多元逐步回归分析提示PAI-1与收缩压水平、总胆固醇和vWF呈显著正相关.高血压组给予氯沙坦50～100mg/d治疗,疗程6周,收缩压和舒张压明显下降;PAI-1活性较治疗前明显降低;而tPA活性较治疗前升高;ISI和vWF在治疗后无明显变化.结论高血压病人存在一定程度的胰岛素抵抗和凝血、纤溶功能紊乱.氯沙坦治疗能有效降低病人的血压,同时可以改善高血压病人的纤溶活性.     

婴幼儿呼吸道疾病B淋巴细胞状况分析

用流式细胞术测定婴幼儿哮喘、婴幼儿肺炎、婴幼儿急性上呼吸道感染患儿外周血淋巴细胞CD19、CD19+ CD2 3+ 表达 ,用化学发光免疫法测定其血清总IgE水平 ,以探索婴幼儿呼吸道疾病时B淋巴细胞及其活化状况。结果表明 ,婴幼儿哮喘组CD19+ 、CD19+ CD2 3+ 表达、血清总IgE水平明显增高 ,婴幼儿肺炎、婴幼儿急性上呼吸道感染无升高 ;婴幼儿哮喘组CD19的表达阳性率和绝对值分别与CD19+ CD2 3+ 表达阳性率和绝对值均呈正相关。提示婴幼儿哮喘存在明显的B淋巴细胞数量增多及活化异常 ,婴幼儿肺炎和婴幼儿急性上呼吸道感染B淋巴细胞状况无明显改变     

血小板活化标志物及其临床意义

循环血液中处于静息状态的血小板在各种理化和生物因子作用下 ,使血小板内的颗粒膜糖蛋白迅速发生数量重排和构型变化而激活成为活化血小板。活化血小板是体内血栓形成的主要成份。在各种血栓性疾病和血栓前状态的发生和发展过程中 ,发挥了重要的病理生理作用     

应用高效毛细管电泳技术快速分离尿肌酐

目的建立1种快速测定尿中肌酐浓度的毛细管电泳方法.方法用pH2.5、0.1 mmol/L磷酸作为电泳缓冲液,利用非涂层石英毛细管48.5 cm×50 μm(id),采用外标法定量,检测波长191 nm.结果本法在34.5～8 840 μmol/L浓度范围内呈良好的线性(r=0.998),日内和日间变异系数分别为3.5%、6.2%,平均回收率94.7%.与苦味酸法有良好的相关性(Y=1.004X+0.004,r=0.998,n=45).结论本法线性范围宽、简单、快速,可应用于临床样品的检测.     

整合子中氨基糖苷-3″-腺苷酰基转移酶多克隆抗体的制备与初步应用

目的 制备氨基糖苷-3″-腺苷酰基转移酶[AAD(3″)]特异性抗血清,并探讨其在检测第1类整合子8种不同可变区启动子(PcS、PcH2、PcH1、PcW、PcS-P2、PcH2-P2、PcH1 -P2和PcW-P2)下游基因盒中aadA2基因表达水平的应用价值.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增aadA2基因,并克隆至表达载体pET19b中,诱导表达并纯化带组氨酸标签的重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔制备抗AAD(3″)特异性抗血清.以制备的抗AAD(3″)抗血清为一抗,用免疫印迹法(WB)检测不同可变区启动子下游基因盒中aadA2基因的翻译水平,用微量肉汤稀释法检测链霉素对含不同可变区启动子及其下游aadA2基因盒的大肠埃希菌JM109的最低抑菌浓度(MIC).结果 成功构建重组的AAD(3″)蛋白表达质粒pET1 9b-aadA2,经测序确认转化大肠埃希菌BL21( DE3)获得1株高表达可溶性重组AAD(3″)蛋白的工程菌株,发酵后用镍柱纯化获得纯度＞90％的重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔获得效价＞ 1∶100 000的抗AAD(3″)特异性抗血清.WB检测8种不同可变区启动子下游aadA2基因翻译产物AAD(3″)蛋白的表达水平,设定启动子PcW下游AAD(3″)蛋白的相对表达水平为1,重复3次测得启动子PcS、PcH2、PcH1、PcS-P2、PcH2 -P2、PcH1-P2及PcW-P2下游AAD(3″)蛋白相对表达水平依次为12.9±2.3、9.1±1.0、2.0±0.4、16.0±1.3、14.1±1.3、10.5±0.7、8.9±1.7,且不同可变区启动子下游AAD(3″)蛋白的相对表达水平差异具有统计学意义(F=32.421,P＜0.01).微量肉汤稀释法重复3次测得链霉素对含启动子PcS、PeH2、PcH1、PcS-P2、PcH2-P2、PcH1 P2、PcW、PcW-P2及其下游aadA2基因重组质粒的大肠杆菌JM109的MIC平均值依次为256、256、64、128、32、128、4、64 mg/L,表明不同可变区启动子下游aadA2基因的表达水平不同可赋予宿主细菌对链霉素产生不同水平的耐药.结论 成功纯化出可溶性重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔获得高效价的抗AAD(3″)特异性抗血清,为进一步研究整合子中整合酶基因与可变区基因盒表达之间的相互关系奠定基础.不同可变区启动子下游耐药基因盒的表达水平明显不同,赋予宿主细菌对相应抗菌药物的耐药水平明显不同,因此在对临床菌株进行第1类整合子分子流行病学调查时,应重视可变区启动子分类方面的研究.