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【目的】表达鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶(AvPAL),并经分子改造降低其最适反应pH。【方法】PCR克隆AvPAL编码基因,并在大肠杆菌中表达,用Ni2+亲和层析柱和凝胶柱纯化重组蛋白。利用GETAREA软件筛选与催化残基距离较近的暴露于酶分子表面的氨基酸位点,将其突变为带电性质不同的氨基酸,并对突变体进行酶学性质研究。【结果】在大肠杆菌中成功表达了AvPAL,纯化后得到电泳纯的重组酶。突变体E75Q和E75R的最适反应pH从8.5分别偏移到7.5和7.0。E75Q在pH 7.5时的比酶活较原酶提高了25%,在pH 6.5–9.5之间酶的稳定性良好,其最适反应温度为50 °C,在此温度下保温1 h酶活无显著变化。在最适反应条件下,E75Q的kcat/Km值较原酶提高了26.6%。【结论】改变AvPAL酶分子中起路易斯碱作用的关键氨基酸残基(质子受体)附近与之有相互作用的氨基酸的带电性质,降低了AvPAL的最适反应pH,提升了其在医疗领域的应用前景。 相似文献
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C2H2+Ar处理医用涤纶材料的细菌粘附 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:对最常用心脏血管替代材料涤纶片作最新发展的具有全方位表面改性特征的混合等离子体浸没注入,以观察经处理后的涤纶片抑制细菌粘附的效果。方法:用多功能全方位等离子体浸没及离子注入机(PⅢ),用射频电源建立气体等离子体,对涤纶材料作全方位乙炔和氩气混合离子(C2H Ar)注入获取表面改性涤纶片。用金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,大肠杆菌,绿脓杆菌,白色念珠菌制取细菌悬液并作5-^125I-2’-脱氧尿嘧啶核苷(^125I-UDR)标记,再对改性涤纶材料作体外细菌动态粘附实验。结果:表面改性涤纶材料改变了亲水性和表面能,降低了水分子接触角。与未改性材料相比,改性涤纶材料抗细菌粘附能力有较明显提高。结论:混合离子(C2H2 Ar)表面改性涤纶片有良好的抗细菌和血小板粘附能力。 相似文献
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目的:研究长期酒精暴露对大鼠不同脑区肌动蛋白结合蛋白cofilin表达的影响。方法:雄性SD大鼠24只,随机等分为慢性酒精暴露1月组(E1组)和2月组(E2组),各饮酒组均设对照组(C1组、C2组),每组大鼠6只。参照文献制作实验动物模型,给慢性酒精暴露组大鼠自由饮含低浓度乙醇(体积分数为6%)的水溶液,对照组大鼠正常饮自来水。撤除酒精后6 h进行戒断症状评分,并分别处死各组大鼠取脑组织。采用免疫组织化学方法检测各组大鼠前额叶皮质和海马CA1区cofilin蛋白的表达水平。结果:饮酒组大鼠撤除酒精后出现明显的戒断症状。在前额皮质区,E1组大鼠cofilin表达水平较C1组显著升高(P < 0.05),E2组大鼠cofilin表达水平较C2组显著升高(P < 0.01);在大鼠海马CA1区,E1组cofilin表达水平较C1组显著升高(P < 0.05),E2组cofilin表达水平较C2组相比无显著差异(P > 0.05)。结论:长期酒精暴露可导致大鼠前额皮质及海马CA1区肌动蛋白结合蛋白的表达变化。 相似文献
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Artificialorganswhichhavetocontactwithbloodforalongterm,suchasartificialheartvalvesandartificialheart,needgoodbloodcompatibility.Lowtemperatureisotropicpyrolyticcarbon(LTIcarbon)isusuallyusedforfabricationofartificialheartvalvesnow.Butitsbloodcompatibil… 相似文献
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用离子束增强沉积 (IBED)方法 :即在氧气氛中 ,通过惰性气体Xe+离子轰击和Ti的电子束蒸发进行了氧化钛薄膜的合成 .X射线衍射分析表明 ,用离子束增强沉积技术合成的薄膜为金红石结构 ,具有 ( 10 0 )择优取向 .用背散射技术分析了薄膜的成分 ,发现薄膜的O/Ti基本上接近 2∶1.薄膜中含有一定量的Ti2 +和Ti3+.体外试验及动物体内试验结果表明 ,金红石型氧化钛薄膜具有比目前临床应用的热解碳更好的血液相容性 .并认为 ,金红石型氧化钛覆膜热解碳极可能成为新的人工心脏瓣膜材料 . 相似文献
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为了解口虾蛄野生种群的遗传多样性水平,采集了4个不同地理种群的口虾蛄44个样品,利用线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基序列为分子标记,初步分析了口虾蛄野生群体的遗传多样性及遗传结构。研究共获得627bp的COⅠ序列,检测到27个单倍型,30个变异位点。在4个种群中,燕尾港与射阳种群、赣榆与连岛镇种群、赣榆与燕尾港种群之间存在明显的遗传分化,但在贝叶斯系统树中未形成明显的地理分化格局;4个野生种群都有高的单倍型多样性水平和相对低的核苷酸多样性水平;歧点分布及中性检验均支持口虾蛄野生种群在历史上发生快速扩张事件。 相似文献
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该文旨在建立一种稳定高效的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒构建方法,并将所制备的假病毒用于评估抗体中和水平。通过比较不同穿梭质粒、质粒配比以及转染试剂对假病毒滴度的影响,优化制备高滴度假病毒的条件;通过制备不同的SARS-CoV-2突变株假病毒,测试该方法的稳定性;利用所制备的假病毒对SARS-CoV-2抗体的中和能力进行评价,测试该方法的可靠性。优化结果表明,当使用LipofectamineTM3000作为转染试剂时,pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP?psPAX2?pcDNA3.1-S以0.300μg?0.225μg?0.240μg的质量比转染获得的假病毒滴度最高。进一步,发现利用该方法包装的三种突变株的假病毒均可达到较高滴度。利用该方法制备的假病毒可以用于SARS-Co V-2抗体的中和活性检测,测得IC50值为0.126μg/m L。该研究成功建立了一种简单高效的制备新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒的方法,其可用于体外评估SARS-CoV-2抗体中和活性,为研发SARS-CoV-2相关疫苗和药物的体外评... 相似文献
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该研究旨在利用hACE2真核表达载体,通过电转法获得具有新型冠状病毒易感性的稳定表达hACE2的293T细胞株。将线性表达质粒pCMV-hACE2电转至293T细胞,经潮霉素B筛选后,利用间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、Western blot、流式分析法鉴定hACE2的表达,S-RBD蛋白和SARS-CoV-2假病毒分析细胞功能活性。利用250 μg/mL潮霉素B筛选获得了稳定高表达hACE2的细胞系293T-hACE2-D4。在该细胞中,RT-PCR检测到了大量hACE2基因的mRNA,Western blot、间接免疫荧光和流式分析法检测细胞表面hACE2蛋白表达情况(阳性细胞率为86.86%)。功能分析中,293T-hACE2-27-D4细胞不仅能够与SARS-Cov-2 S-RBD蛋白相结合(结合率达84.26%),并且能够成功感染新型冠状病毒假病毒。该研究构建的稳定表达hACE2的293T细胞不仅能与S-RBD蛋白结合,还对新冠假病毒具有易感性,是探究病毒感染机制的有利工具。 相似文献
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【背景】MIO(Methylidene-imidazol-5-one)依赖型酶中,催化因子Tyr所在Loop(Tyr78-loop)的灵活性显著影响酶学性质。【目的】探讨Tyr78-loop对鱼腥藻来源苯丙氨酸脱氨酶酶活的影响,以提高其反应活性。【方法】将该酶的Tyr78-loop进行分子改造,筛选出酶活提高的突变体,并对突变体的酶学性质进行研究。【结果】突变体S73N、E95V、E95K和S73N/E95K在37°C、pH 8.5下比活分别比原酶提高了34%、30%、18%和35%。蛋白三维结构模拟推测在突变体S73N、E95V和E95K中,位于α螺旋与Tyr78-loop交界处的Asn73、Val95和Lys95与附近氨基酸的氢键作用力数目减少,一定程度上增加了Tyr78-loop的柔性。【结论】Ser73位和Glu95位氨基酸的突变增加了Tyr78-loop的灵活性,提高了苯丙氨酸脱氨酶的酶活。 相似文献
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病毒噬斑形成实验是确定病毒滴度的重要方法,其中噬斑染色是非常关键的步骤,而良好的固定液不仅能够维持细胞形态,也能起到助染作用,是有效识别病毒噬斑的关键因素.为了研究不同固定液对Vero E6细胞形态和结晶紫染色效果的影响,本研究采用五种固定液对Vero E6细胞进行固定(100%甲醇、4%甲醛、10%甲醛、75%乙醇和95%乙醇).以只加PBS缓冲液的细胞作为对照组.细胞固定30 min后利用1%结晶紫进行染色.利用光学显微镜和肉眼观察细胞形态,从而评价固定和染色效果.结果 显示,10%甲醛的细胞固定效果最佳,细胞形态良好,细胞染色均匀且着色深,利用该固定剂能在病毒噬斑实验中很好的识别噬斑,是Vero E6较为理想的固定剂. 相似文献