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白蛋白融合α-2b干扰素在毕赤酵母中的表达 总被引:7,自引:0,他引:7
α2b干扰素的重组表达质粒pPIC9KHSAIFNα2b经限制性内切酶SalI酶切线性化后电转化巴斯德毕赤酵母菌(P.Pastoris)SMD1168,将阳性转化子进行PCR鉴定和Mut表型鉴定并用甲醇诱导表达,WesternBlot结果表明白蛋白融合IFNα蛋白与IFNα抗体具有结合能力,Wish细胞VSV病毒系统鉴定表达蛋白具有抗病毒生物活性。在摇瓶培养条件下,甲醇在0.5%~4.0%的范围,随着浓度的升高蛋白表达量也升高,在其他因素固定时,菌体起始OD值在5~80的范围内,随着OD值的升高表达量反而下降。成功表达出具有高生物学活性的白蛋白融合干扰素蛋白(HSAIFNα2b),为进一步应用打下基础。 相似文献
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利用PCR技术构建RGD短肽与人肿瘤坏死因子凋亡配体(胞外区114-281)的融合基因,将该DNA片段克隆到原核表达载体pET-11a中。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后可表达相对分子质量约为20000的目的蛋白,占菌体蛋白的20%左右,且大多数重组蛋白以不溶的包涵体形式存在。Western印迹表明目的蛋白具有人sTRAIL的抗原性。表达产物经变性、复性、离子交换层析和分子筛等步骤,可以得到纯度大干95%的RGD-sTRAIL重组蛋白。肿瘤细胞体外实验发现,纯化后的RGD-sTRAIL重组蛋白能明显抑制人肺癌细胞A549生长,并呈剂量依赖性。研究结果表明,通过复性,包涵体中的RGD-sTRAIL蛋白得到正确的折叠,并在体外具有杀伤肿瘤细胞的活性,从而为进一步研究体内靶向性杀伤肿瘤细胞奠定了基础。 相似文献
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研究重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白(rHSA-IFNα-2b)的稳定性.以抗病毒活性和纯度为主要检测指标,考察rHSA-IFNα-2b的热稳定性,酸碱稳定性以及冻融耐受性.rHSA-IFNα-2b在37℃、55℃下放置5h后生物学活性无明显降低,60℃水浴lh即可见活性降低了约40%;pH值(分别为2、3、9)改变时,生物学活性未发生明显变化;rHSA-IFNα-2b反复冻融后聚合体逐渐增加,冻融4次后聚合体含量达到17.91%,但生物学活性无明显降低.重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白对热、酸碱变化稳定,但不宜冻融. 相似文献
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人干扰素α-2b原始基因在重组原核工程菌中表达量偏低,所以我们在不改变干扰素原有氨基酸组成的前提下,根据大肠杆菌密码子偏爱性使用定向突变技术对huIFNα-2b基因进行点突变。将大肠杆菌STⅡ信号肽基因与突变后huIFNα-2b基因融合并于信号肽5′端和huIFNα-2b基因3′端引入合适的酶切位点。融合基因克隆至载体pCSE,pET-22b和pPAK4L中,此3种载体分别含有组成型启动子、T7启动子和phoA启动子。融合基因在载体pCSE中表达量很低,其中约有50%的目标蛋白能够成功实现分泌。在E.coliBL21中,pET-22b经过IPTG诱导可以实现huIFNα-2b的高表达,但STⅡ信号肽不能被有效切除。含有phoA启动子的载体pPAK4L其在E.coliW3110中可以实现huIFNα-2b较高水平的分泌表达,经过低磷诱导其表达量最高可至20μg/mL(A550)菌液,约有30%的目标蛋白质信号肽能够被成功切除并分泌到胞间质中。 相似文献
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hTNFRII-Fc融合基因的克隆及在CHO细胞中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
构建人肿瘤坏死因子受体II胞外区(TNFRII)和人免疫球蛋白(IgG1)Fc段的融合基因真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达融合蛋白hTNFRII-Fc。用全合成重叠延伸PCR方法克隆TNFRII胞外区的基因片段,再与(IgG1)Fc段拼接起来形成hTNFRII-Fc融合基因,经HindIII、EcoRI双酶切后插入至pEE14中构建pEE14-TNFRII-Fc真核表达载体,脂质体转染至CHO细胞中进行表达及鉴定。ELISA检测到转染hTNFRII-Fc基因的CHO细胞培养上清中含有hTNFRII-Fc蛋白,SDS-PAGE与Western-blot鉴定证实其为hTNFRII-Fc蛋白,为进一步研究该融合蛋白在CHO细胞稳定表达及应用于类风湿关节炎等自身免疫性疾病临床治疗奠定了一定的研究基础。 相似文献
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毕赤酵母作为比较成熟的真核表达系统[1],它具有许多优点,表达产物直接分泌到胞外,这有利于产物的分离纯化.白蛋白干扰素在毕赤酵母中表达的研究也具有很重要的意义.研究白蛋白与干扰素之间的接头蛋白不同对表达量的影响.通过重叠PCR构建不同接头的白蛋白干扰素重组子,然后分别用salⅠ酶切线性化,通过电转仪转入毕赤酵母SMD1168,在MD板上进行培养,分别挑取10个克隆进行甲醇诱导表达,筛选出表达量最高的一个.最后在相同的条件下,分别将表达量高的进行诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE鉴定,由于表达产物中有杂蛋白,通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定融合白蛋白干扰素的表达量,由已知浓度的白蛋白干扰素标准曲线,可以计算出不同接头的白蛋白干扰素的表达量,这对工业化生产具有指导意义. 相似文献
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重组人粒细胞集落刺激因子的表达、纯化以及PEG修饰 总被引:1,自引:0,他引:1
重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)经大肠杆菌温度诱导表达后,其表达产物以包涵体形式存在,包涵体经过变性、复性和分离纯化等步骤处理后得到纯化的rhG-CSF.在一定的实验条件下用单甲氧基聚乙二醇活性酯(mPEG20k-NHS)对rhG-CSF进行化学修饰,所得修饰产物经分离纯化后获得PEG20K-rhG-CSF偶联物.与修饰前的rhG-CSF相比较,尽管修饰后的rhG-CSF体外生物学活性下降至修饰前的20%左右,但其在体内的作用时间能够得到显著的延长,药效有了明显提高. 相似文献