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生技霉素稳定型基因工程菌的构建* 总被引:5,自引:0,他引:5
运用同源重组技术将异戊酰基转移酶基因整合至螺旋霉素产生菌(Streptomyces spiramyceticus F21) 的染色体上,构建了稳定的生技霉素基因工程菌。在不加压的情况下传代,菌种携带选择性遗传标记情况、生长、发酵效价及发酵产物的TLC分析均表明此基因工程菌有较好的遗传稳定性,且发酵效价及产物的组分均得到改善。Southern杂交证明外源基因在螺旋霉素产生菌染色体上的整合情况。 相似文献
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大环内酯类抗生素基因工程是近年来生物工程领域研究的一个热点 ,利用基因工程改造大环内酯类抗生素合成基因 ,已经合成了 10 0多种“非天然”的天然化合物 ,为筛选新抗生素开辟了新的途径。本研究以糖多孢红霉菌A2 2 6基因组DNA为模板 ,先用PCR扩增出红霉素合成基因eryKR6两侧片段 ,再用重叠PCR将其拼接成去除KR6的约 3.2kbDNA片段 ,并克隆于pWHM3载体 ,构建了同源重组质粒pWHM2 2 0 1。用PEG介导将pWHM2 2 0 1转入糖多孢红霉菌A2 2 6原生质体。PCR鉴定和生物活性检测均显示pWHM2 2 0 1已重… 相似文献
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麦迪霉素产生菌具有启动功能的DNA片段的克隆和分析 总被引:3,自引:0,他引:3
利用启动子探针质粒载体pIJ486从麦迪霉素产生菌总DNA中克隆得到了一段具有启动功能的DNA片段.通过限制性酶酶切分析,测定插入DNA片段大小为2.3kb.又利用载体pIJ486和pIJ487的新霉素抗性结构基因上游有多酶切点方向相反的性质,分析了插入片段在两个不同方向上的启动能力.结果表明,在两个方向上均有启动功能,但强弱相差六倍.其中在XbaI-HindIII方向上具有较强的启动能力,在变铅青链霉菌中新霉素抗性水平可达20mg/ml以上.进一步对插入片段的三个BamHI小片段进行分析的结果表明,较强启动子区域集中在BamHI-BamHI 0.79kb DNA片段上. 相似文献
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拟研究异源调控系统提高耐热链霉菌Streptomyces thermotolerans 4″-O-异戊酰基转移酶基因(ist)表达的可能性。在麦迪霉素产生菌Streptomyces mycarofaciens 1748中曾克隆到BamHⅠ~8.0 kb片段,含此基因片段的变铅青链霉菌TK24 Streptomyces lividans TK24转化子可将螺旋霉素高效转化为丙酰螺旋霉素。序列分析表明此片段除包含麦迪霉素4″-O-丙酰基转移酶基因(mpt)外还存在与其连锁的两个正调控基因orf27和orf28。将这个基因簇中mpt基因的orf替换为ist基因的orf,然后与两个正调控基因或者单独一个orf27连接,将这些构建好的片段分别克隆到中等拷贝数及高拷贝数载体pKC1139和pWHM3上,再转化到S.lividans TK24中。通过测定S.lividans TK24转化子中螺旋霉素生物转化为4″-O-酰化螺旋霉素的产率来评价mpt和ist基因的表达水平。结果表明只有高拷贝载体pWHM3构建的重组质粒S.lividans TK24转化子中才能明显检测到4″-O-异戊酰螺旋霉素的产生。mpt基因的正调节系统可以提高ist基因的表达水平,含两个调节基因的转化子转化效率高于含单一调节基因的转化子。 相似文献
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大环内酯类抗生素基因工程是近年来研究的一个新领域,迄今已合成了100多种新的聚酮类化合物。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板,用重叠PCR方法扩增出去除KR6酶域DNA的约32kb DNA片段,克隆于pWHM3载体,构建了同源重组质粒pWHM2201。PEG介导原生质体转化法将pWHM2201转入糖多孢红霉菌A226,并整合于染色体红霉素合成基因位点。整合体在R3M斜面上生长两代后,制备原生质体涂R3M平皿。利用PCR鉴定筛选出8株KR6敲除的突变体糖多孢红霉菌M(1-8)。ZabsPec Fab质谱鉴定,证实糖多孢红霉菌M1合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,一种新的酮内酯类化合物。
〖HJ0 相似文献
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链霉菌C-3662产生的纤溶活性蛋白酶的纯化与理化性质 总被引:10,自引:0,他引:10
从链霉菌 C- 3662发酵上清液中 ,通过硫酸铵沉淀 ,CM- Sepharose Fast Flow和 Phenyl-Sepharose Fast Flow等层析色谱 ,分离纯化得到了具有纤溶活性的蛋白酶 CGW- 3,反向 HPLC鉴定纯度为 90 % ;每立升发酵上清液可得到 8mg纯品 ,活性回收率 46% ,CGW- 3为一单肽链蛋白 ,分子量 2 2 72 1 ,对丝氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF敏感 ,对 EDTA不敏感 ;其 N端 1 5个氨基酸的顺序为 VVGGTRAAQGEFPFM,与微生物来源的胰蛋白酶类丝氨酸蛋白酶有较高的同源性 . CGW- 3的等电点 p I9.0 ,纤溶活性的最适 p H为 7.5~ 8.0 ,对温度比较敏感 .CGW- 3不仅具有直接降解纤维蛋白作用 ,而且能够激活纤溶酶原 相似文献
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用PCR技术将本室克隆到的强启动功能片段取代麦迪霉素丙酰化酶基因(mpt)的启动子或与mpt基因自身启动子串连,获得含mpt重组质粒pCHFPE3和pCHFPE2。用含有这两个质粒的Streptomyces lividans TK24对螺旋霉素进行微生物转化,结果表明,与含有原启动子的mpt.S.Lividans TK24(p.WFPE)相比,丙酰螺旋霉素的组分比例分别提高了89.02%和58.53%。含重组质粒pCHFPE2的螺旋霉素产生菌S.Spiramyceticus发酵产物中丙酰螺旋霉素的组分也有较大辐度的提高。说明利用该强启动功能片段可以提高麦迪霉素丙酰化酶基因的表达。 相似文献
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利用PCR技术将本室克隆到的强启动功能片段取代麦迪霉素丙酰化酶基因(mpt)的启动子或与mpt基因自身启动子串连,获得含mPt重组质粒pCHFPE3和pCHFPE2。用含有这两个质粒的Streptomyces lividans TK24对螺旋霉素进行微生物转化,结果表明,与含有原启动子的mpt.S.lividans TK24(p.WFPE)相比,丙酰螺旋霉素的组分比例分别提高了89.02%和58.53%。含重组质粒pCHFPE2的螺旋霉素产生菌S.spiramyceticus发酵产物中丙酰螺旋霉素的组分也有较大辐度的提高。说明利用该强启动功能片段可以提高麦迪霉素丙酰化酶基因的表达。 相似文献
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糖多孢红霉菌同源片段长度与染色体重组率关系的研究 总被引:6,自引:0,他引:6
为了探索同源片段长度与糖多孢红霉菌染色体同源重组率的关系,化学合成或用重叠PCR合成带有突变位点、在突变位点两侧长度为(26bp+27bp)、(500bp+576bp)和(1908bp+1749bp)的同源序列,克隆于糖多孢红霉菌同源重组载体pWHM3后,分别构建了pWHM1113、 pWHM1116和 pWHM1119质粒。以PEG介导转化糖多孢红霉菌A226原生质体,3个质粒分别获得每皿30个、69个和170个转化子,但pWHM1113质粒不能与染色体有效整合,pWHM1116质粒与染色体整合率为转化子的2%,而pWHM1119质粒与染色体整合率达到转化子的19%。 pWHM1116和 pWHM1119质粒均可进行有效的染色体二次重组,将突变位位点引入染色体。因此,同源片段长度为(500bp+576bp)或更长时,可与糖多孢红霉菌染色体进行有效的单重组和双重组。 相似文献