小鼠beta-防御素2真核表达载体的构建及表达

构建小鼠heta-防御素2(murie beta-defensin 2,mBD2)的真核表达载体pcDNA-mBD2,并观察其在真核细胞中的表达.从小鼠肝组织中提取mRNA通过逆转录聚合酶链反应扩增得到mBD2基因,定向克隆至真核表达栽体pcDNA3.1(+)获得pcDNA-mBD2;经酶切和测序鉴定构建正确,应用脂质体法转染siha细胞,并通过蛋白免疫印迹法检测细胞内mBD2的表达.结果显示,构建了小鼠mBD2的真核表达载体,转染siha细胞培养并采用G418稳定筛选后,获得稳定转染细胞,收集并裂解转染细胞,蛋白免疫印迹法检测到转染细胞内mBD2的表达.成功构建了真核表达裁体pcDNA-mBD2,为研究mBD2在宫颈癌发生发展过程中的作用及作用机制奠定基础.     

重组泡球蚴Em18蛋白不同纯化方法的比较

目的：比较不同方法纯化重组泡球蚴Em18的效果。方法：进一步对BL21-pET41a-Em18重组菌的诱导表达条件进行摸索优化,采用改良的超声程序破碎大肠杆菌细胞,分别经不同的纯化方法进行蛋白纯化,通过SDS-PAGE对纯化结果进行比较分析,Western blot进行活性鉴定。结果：①在菌液OD600为0.8-1.0,加IPTG终浓度为1 mmol/L,37℃诱导3h,rEm18-GST重组蛋白得到成功高表达,在相对分子量为50kDa处有表达条带。②超声程序为：工作3 s,间歇4s,功率200~300W,超声体系中加入溶菌酶和蛋白酶抑制剂作用,可促进大肠杆菌细胞的破碎,降低目的蛋白的降解;加入终浓度为1%的Triton-X100作用可增加融合蛋白的可溶性。③通过比较不同方法纯化重组泡球蚴Em18的效果表明采用单纯His柱纯化可获得浓度高、纯度高的rEm18-GST重组蛋白。Western blot分析表明该蛋白能与泡型包虫病（AE）患者血清特异性反应。结论：建立了一种纯化原核表达Em18融合蛋白的较为经济和有效的方法,得到大量有生物学活性的Em18融合蛋白,为包虫病诊断试剂盒的研制奠定基础。     

小鼠beta防御素2原核表达与抗菌作用的初步研究

构建小鼠β-防御素-2( mouse beta defensins 2,mBD2)原核表达质粒pET32/mBD2,进行蛋白诱导表达及纯化,测定并纯化蛋白的抗菌活性.旨在为选一步研究其生物学特性奠定基础.通过腹腔注射脂多糖(lipopoly-saccharide,LPS)建立小鼠急性时相反应,采用RT-PCR方法扩增mBD2成熟肽,经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pET-32a(+)载体,构建的重组质粒.将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3),采用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达.通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白.将融合蛋白采用肠激酶酶切、洗脱并用滤纸片法测定目的蛋白的抗菌活性.成功构建了原核表达质粒pET32a(+)/mBD2,并转化工程菌BL21( DE3).在0.25 mmol/L IPTG、30℃诱导4h条件下获得的融合蛋白.采用抑菌试验证实蛋白具有一定的抑制革兰阳性菌及阴性菌生长的作用.本研究成功构建了pET32/mBD2原核表达质粒,得到了在大肠杆菌中稳定表达mBD2蛋白.     

细粒棘球蚴EgG1Y162基因进化分析、表达及鉴定

目的:克隆和鉴定细粒棘球蚴的Eg G1Y162基因,分析其蛋白表达和适应性进化并鉴定抗原性。方法:根据em Y162基因序列设计引物,分别从细粒棘球绦虫原头蚴、囊壁生发层、成虫和虫卵四个发育阶段,提取基因组DNA和总RNA,mRNA反转录为c DNA,利用PCR的方法以基因组DNA和c DNA为模板扩增Eg G1Y162基因;构建PUCm-T/Eg G1Y162重组质粒,经PCR、酶切及测序鉴定后,测序确定其正确性。利用DNAman软件与MEGA4软件对Eg G1Y162基因特点进行分析并构建Eg G1Y162核酸序列的进化树进一步探讨其同源性。荧光定量PCR检测Eg G1Y162基因在细粒棘球绦虫原头蚴、囊壁生发层、成虫和虫卵四个不同发育阶段的表达情况。利用定向克隆技术将Eg G1Y162抗原基因片段克隆至原核表达质粒PET-41a上,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序确定序列。IPTG初步诱导和表达Eg G1Y162-GST重组蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blot试验分析鉴定。结果:从细粒棘球绦虫的两个不同发育阶段均克隆出Eg G1Y162基因,从总DNA克隆得到片段长度1 680bp,从c DNA克隆得到片段长度459bp。相似性比较表明,Eg G1Y162基因序列与em Y162相似性为91%,而Eg G1Y162基因c DNA与em Y162相似性为95%。进一步分析显示,Eg G1Y162基因序列由3个外显子和2个内含子组成,外显子区域分别为1~70,1 064~1 380和1 577~1 648。位于疏水端1~16位氨基酸构成Eg G1Y162信号肽序列,35~115位氨基酸形成一个大的纤黏连蛋白剪接体FN3,133~152位氨基酸构成羧基端跨膜区域。测序结果显示Eg G1Y162抗原基因长度为360bp,编码120个氨基酸。通过荧光定量PCR检测,发现Eg G1Y162在成虫、生发层阶段、原头蚴和虫卵阶段均有不同程度的表达。但是Eg G1Y162在成虫中的表达量最多,相对值为19.526,差异有统计学意义(P<0.01),其次生发层阶段,为5.122,再次在原头蚴阶段,相对值为5.083,而在虫卵阶段最少,为1.6588。构建的PET-41a/Eg G1Y162原核表达质粒,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测表明Eg G1Y162-GST重组蛋白得到成功表达,在相对分子量为44k Da处有表达条带。Western blot分析显示阳性印迹条带,分子量为44k Da,Eg G1Y162重组蛋白能与细粒棘球蚴感染40天后犬的血清发生反应;与包虫病患者血清也有阳性反应。结论:成功克隆Eg G1Y162抗原基因,序列对比分析显示Eg G1Y162的c DNA与em Y162的c DNA具有很高的相似性,基因的差异性主要存在于内含子区域,Eg G1Y162抗原基因是一种新的基因。Eg G1Y162在成虫中的表达量最多。成功诱导表达出Eg G1Y162重组蛋白,并且Eg G1Y162重组蛋白具有很好的抗原性。     

基于因素评分法的医院医师岗位评价研究

通过调研,充分了解新疆某三级甲等医院人力资源管理的实际状况和人力资源管理存在的关键问题和薄弱环节。应用现代岗位评价方法对医院医师岗位进行评价,形成医院医师岗位评价体系,为优化医院人力资源配置、薪酬和绩效管理,形成医院内部良性竞争机制提供科学依据。     

棘球蚴囊液对小鼠脾细胞IL-17及Smad2表达的影响

目的:观察细粒棘球蚴囊液对体外培养BALB/c小鼠脾细胞白介素(IL)-17和Smad2基因表达的影响.方法:制备小鼠脾细胞悬液,接种于48孔培养板中进行培养,以不加任何干预为对照组,囊液处理组为实验组.定时取样提取总RNA,经反转录成cDNA后用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测IL-17和Smad2基因的表达.结果:小鼠脾细胞IL-17表达在囊液处理6h和12h后升高(1.000±0.207 VS 3.672±0.746和1.000±0.154 VS 5.525±0.843),差异有统计学意义(P＜0.05);小鼠脾细胞Smad2表达在培养1h后升高(1.000±0.077 VS 2.069±0.098)在12h后降低(1.000±0.110 VS 0.247±0.011),差异有统计学意义(P＜0.05);协同分析发现IL-17基因与Smad2基因的表达变化呈现负相关(P＜0.01),相关系数r=-1.结论:细粒棘球蚴囊液对小鼠脾细胞IL-17和Smad2基因的表达具有上调作用,推测其可能与宿主抗棘球蚴感染的机制有关.