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目的:改造大肠杆菌的代谢途径,使非生产菌株大肠杆菌具备产异丁醇的能力.方法:将乳脂乳球菌NIZO B1157的2-酮酸脱羧酶基因kdcA克隆到大肠杆菌中,使大肠杆菌产异丁醇;另外,采取两种方法过量表达alsS、ilvC、ilvD基因,增加前体物质酮酸的供应,以提高异丁醇的产量:一是与kdcA串联表达;二是在另一个相容质粒中表达.结果:大肠杆菌工程菌具备产异丁醇的能力,其中相关基因在一个质粒中串联表达的产量比其在两个相容质粒中共表达的产量高30倍,达到3g/L.结论:导入的酮酸合成途径与醇类生产途径结合,能使非生产菌株大肠杆菌生产异丁醇,并且单质粒表达代谢途径相关基因的效果优于双质粒表达. 相似文献
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探究pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株对大肠杆菌工程菌发酵生产异丁醇的影响。运用Red重组系统敲除大肠杆菌BW25113的pflB、frdAB、fnr和AdhE基因,构建pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株E.coliBW25113H,结合本实验室已经构建的表达质粒pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA,并检测该工程菌在1L发酵罐的发酵过程中的生物量、突变菌株的稳定性、异丁醇产量及有机酸含量的变化情况。成功获得pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株BW25113H。发酵结果表明,该工程菌能以较长时间,较高比生长速率保持对数生长期,其稳定性较好,异丁醇产量增加了40%。成功构建pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株BW25113H,结合非自身发酵途径使异丁醇的产量由3 g/L提升至4.2 g/L。 相似文献
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大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响及结构定量化分析 总被引:2,自引:0,他引:2
目的利用激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM)观察大蒜素对铜绿假单胞菌PA01菌株生物膜(biofilms,BF)形成过程的影响,并用ISA(Image Structure Analyzer)软件对BF结构进行定量化分析。方法体外建立1d.3d和7d组PA01菌株BF模型,每组分3小组,分别用生理盐水、大蒜素128μg/mL、大蒜素10μg/mL作用6h。通过荧光探针SYT09/PI标记,利用CLSM进行动态观察,并用ISA软件对其BF结构进行定量分析。结果(1)生理盐水对照组铜绿假单胞菌生物膜厚度随时间的增加而增加,但在后3d增加的速度减慢;同时区域孔率(Areal Porosity,AP)呈下降趋势,平均扩散距离(Average Diffusion Distance,ADD)有逐渐增加趋势,结构熵(Textural Entropy,TE)有增加的趋势。(2)7d组模型中,大蒜素128μg/mL作用后,BF厚度由(28.83±0.67)μm减低到(16.50±0.69)μm;AP由0.76±0.10增加到0.92±0.02;TE由6.78±0.93减低到5.61±0.55。10μg/mL大蒜素干预后,有同样趋势,但效应不如高浓度明显。(3)1d、3d模型组,大蒜素作用后同对照组相比,厚度、AP、TE的差异均有统计学意义,趋势同7d组。结论通过ISA软件对干预前后的BF进行结构定量分析,大蒜素对各个时间段BF的形成均有影响,高浓度效果更显著。 相似文献
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为探讨膀胱癌相关蛋白磷酸酶2A催化亚单位(BCAPP2Ac)新基因在膀胱癌组织中的表达及其对膀胱癌细胞增殖的影响,通过合成抗原多肽免疫家兔获得抗BCAPP2Ac多克隆抗体及通过慢病毒感染方式获得稳定表达BCAPP2Ac的膀胱癌细胞.采用实时PCR及免疫组化染色方法检测BCAPP2Ac mRNA和蛋白在膀胱癌组织、癌旁组织及其它多种肿瘤组织中的表达;用细胞增殖实验检测BCAPP2Ac对膀胱癌细胞增殖的影响.实时PCR及免疫组化结果显示,BCAPP2Ac mRNA及蛋白在膀胱癌组织较癌旁组织表达明显下调;过表达BCAPP2Ac能抑制膀胱癌EJ、T24细胞的增殖, 蛋白磷酸酶2A催化结构域缺失(△PP2Ac)能逆转BCAPP2Ac的增殖抑制作用.研究结果提示,新基因BCAPP2Ac能抑制膀胱癌细胞的增殖,PP2Ac结构域在其抑制细胞增殖作用中发挥重要作用. 相似文献
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大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜早期黏附及胞外多糖的影响 总被引:2,自引:2,他引:2
目的研究大蒜素对铜绿假单胞菌PA01菌株生物膜(biofilm,BF)早期黏附及胞外多糖复合物(Extracellular Polymeric Substances,EPS)的影响。方法利用荧光多功能酶标仪检测各组不同时间点96孔板中pGF-Puv转化PA01菌株的荧光强度,计算黏附率以表示干预对不同时间点细菌黏附的影响,利用荧光显微镜下定性观察细菌的黏附量;应用异硫氰酸标记的刀豆蛋白A(FITC conjugated concanavalin A,FITC-conA)特异性结合细菌EPS,荧光显微镜下定性观察各组EPS的变化;利用硫酸-苯酚法定量各组细菌EPS的产量。结果6h组,大蒜素高浓度干预后细菌的黏附率由0.70±0.03下降至0.50±0.01,t=15.014,P〈0.05,大蒜素低浓度干预后黏附率也有下降,但不及高浓度组明显;除了9h组其他时间组趋势与6h组大致相似,可能与大蒜素含量下降有关。荧光显微镜观察可见生理盐水对照组细菌菌落分布,干预组黏附的细菌稀疏散在分布,以高浓度为甚。FITC-conA可使胞外多糖显色,在荧光显微镜下观察可见大蒜素干预后EPS减少,稀薄;EPS定量实验,EPS总量大蒜素高浓度干预组(181.19±1.59)μg较生理盐水对照组(602.66±21.94)μg有明显降低,t=60.589,P〈0.05。结论大蒜素可显著减少PA01菌株黏附及产EPS的能力。 相似文献
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大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜群体密度感应系统调控毒力因子表达的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
目的通过体外测定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体密度感应(Quorum Sensing,QS)系统调控的毒力因子表达,比较大蒜素干预前后毒性因子表达的差异以及对铜绿假单胞菌PAO1成熟生物膜(biofilm,BF)的影响。方法应用ELISA法比较处理前后外毒素A的含量差异;利用弹性蛋白一刚果红染色的方法,测定处理前后弹性蛋白酶活性;用蒽酮一硫酸法测定鼠李糖脂;利用荧光酶标仪检测青脓素含量变化;利用激光共聚焦显微镜观察干预前后大蒜素对铜绿假单胞菌成熟BF的影响。结果大蒜素干预后与生理盐水对照组比较,外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂和青脓素表达分别由(19.630±0.573)pg/μl、(0.467±0.003)、(2.009±0.063)g/L、(9325.833±367.675)下降到(6.529±0.289)pg/μl、(0.032±0.001)、(0.269±0.009)g/L、(7819.167±111.800)。激光共聚焦显微镜观察可见生理盐水对照组细菌菌落云集呈蘑菇状分布,干预组黏附的细菌稀疏散在平坦分布。结论大蒜素可抑制铜绿假单胞菌群体密度感应系统调控的毒力因子表达,减弱其毒力,干扰BF分化成熟。 相似文献
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目的研究群体感应(quorum sensing,QS)系统在铜绿假单胞菌生物膜(biofilm,BF)形成中的作用。方法体外建立QS系统完整的铜绿假单胞菌野生型PAO1菌株与QS系统缺陷(lasI rhlI基因缺陷△lasI△rhlI)型菌株生物膜模型,通过SYT09/PI荧光探针标记,结合激光共聚焦显微镜摄取BF不同层面的图片,经图像结构分析(ISA)软件分析获得QS系统lasI rhlI缺陷株、PAO1菌株BF相关空间结构参数。结果培养第3天PAO1菌株可形成较厚、有孔状通道的成熟BF结构,而△lasI△rhlI菌株仅形成明显稀薄的早期BF结构,△lasI△rhlI菌株的3 dBF厚度为(6.62±0.31)μm,PAO1菌株为(21.64±0.57)μm(t=0.205,P0.05),区域孔率(areal porosity,AP)分别为0.902±0.006、0.970±0.003;平均扩散距离(average diffusion distance,ADD)和结构熵(textural entropy,TE)在△lasI△rhlI菌株分别为1.571±0.019和6.586±0.110;在PAO1菌株分别为1.467±0.015和5.213±0.111,△la-sI△rhlI菌株AP较PAO1菌株低(t=0.335,P0.05);而ADD、TE较PAO1菌株高(t=0.289,t=0.300,P0.05)。结论lasI rhlI基因缺陷明显影响铜绿假单胞菌的BF形成能力,QS系统在铜绿假单胞菌BF形成中发挥重要作用。 相似文献