山东地区犬冠状病毒的分子流行病学调查及其基因型多样性分析

【目的】了解分析山东地区健康犬及腹泻犬中犬冠状病毒(CCoV)的分子流行病学及其基因型。【方法】采集2017年以来山东省宠物市场、流浪犬中心、犬舍、各地宠物医院等的健康和腹泻犬只的肛拭子样品,采用PCR方法检测CCoV及其CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ(CCoV-Ⅱa和CCoV-Ⅱb)基因分型情况,并对扩增出的M、S全基因进行测序分析。【结果】199份样品中,共检出CCoV阳性样品79份,健康犬中的检出率为40.2%(33/82),腹泻犬中的检出率为39.3%(46/117)。健康犬中CCoV-Ⅰ型与CCoV-Ⅱ型阳性检出率分别为78.8%(26/33)和51.5%(17/33);腹泻犬中CCoV-Ⅰ型与CCoV-Ⅱ型阳性检出率分别为39.13%(18/46)和80.4%(37/46)。基因型阳性比率分析表明,健康犬中单独感染CCoV-I型的比率最高,为48.5%(16/33);腹泻犬中单独感染CCoV-Ⅱa比率最高,为47.8%(22/46)。测序分析获得48株M基因序列,遗传进化分析表明,12株CCoV-Ⅰ型毒株中除1株外,其余均从健康犬中分离。36株CCoV-Ⅱ型毒株中除7株来自健康犬外,其余均为腹泻犬中获得。获得的3株S全基因均来自腹泻犬且均属于CCoV-Ⅱa亚型。【结论】山东地区犬群中CCoV检出率较高,说明CCoV广泛流行,健康犬和腹泻犬中均存在多重感染情况,健康犬中主要流行CCoV毒株为CCoV-Ⅰ型,腹泻犬中主要流行CCoV-Ⅱa型。     

三株光合细菌的毒性试验研究

以昆明小白鼠为实验动物,对类球红细菌Z1、沼泽红假单胞菌Z2及光合细菌分离株C2采用急性毒性试验、骨髓细胞微核试验和精子畸形试验进行安全性评定。结果表明,急性毒性试验:实验组小白鼠的一般状况、器官含水量、器官系数及血常规检查,与对照组差异均无显著性(P>0.05);骨髓细胞微核试验和精子畸形试验实验组与阴性对照组(生理盐水)差异均无显著性(P>0.05),与阳性对照组(环磷酰胺40 mg/kg)比较,骨髓细胞微核试验差异有极显著性(P<0.01),精子畸形率试验差异有显著性(P<0.05)。以上结果说明,三株光合细菌均不具有毒性。     

新城疫强毒株荧光定量RT-PCR检测技术的建立及应用

基于国内流行的新城疫病毒强毒株F蛋白裂解位点分子特征设计特异性引物及Taqman探针,建立了一种可检测新城疫强毒株的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。通过体外转录法制备cRNA标准品作为阳性模板制作标准曲线以及临床样品的检测绘制出ROC曲线,对诊断指标进行系统评价。结果显示:该方法的标准曲线为Y=-3.390X+38.23,相关系数R~2为0.9999;灵敏度试验显示,该方法的最低检测限为2拷贝/μL,比常规RTPCR高10倍;特异性试验显示该方法与常见禽病病毒无交叉反应;重复性试验的组内和组间的变异系数分别低于1%和1.5%。通过检测1 974份临床样品绘制ROC曲线显示,ROC曲线下面积为0.9861,当Youden Index为93.12时,cutoff值设为35,诊断的敏感性和特异性分别为94.82%、98.3%,与病毒分离方法的Kappa系数为0.919。本研究建立的方法敏感性高、特异性强、重复性好、诊断准确性极好,给实验室提供一种快速、实用的检测临床样品的方法。     

水貂冠状病毒研究进展

水貂冠状病毒(Mink coronavirus,MCoV)属于冠状病毒科α冠状病毒属的成员,通常会引起以卡他性腹泻为主要症状的水貂流行性卡他性胃肠炎(Mink epizootic catarrhal gastroenteritis,ECG).该病已在各国许多貂场暴发,给养貂业造成巨大经济损失.本文总结了自1975年报道ECG以来,水貂冠状病毒的研究进展,包括MCoV的基因组结构、遗传进化分析、受体特点及ECG的诊断及防治,以期引起人们对水貂冠状病毒的重视,为水貂冠状病毒病的防控提供参考.     

蛋白质错误折叠循环扩增技术

目前发现有多种人类及动物疾病是由体内蛋白质的错误折叠引起的,其中朊毒粒病因具有传染性而备受关注.朊毒粒病研究的核心问题之一是正常细胞朊蛋白（PrPc）向异常致病朊毒粒（PrPsc）转变的机制.蛋白质错误折叠循环扩增技术（protein misfolding cyclic amplification,PMCA）就是最新发明的在体外诱导朊蛋白（PrPc）产生错误折叠生成朊毒粒（prpsc）的技术.该文将概要介绍此项技术的原理、技术要点及在诊断与基础研究方面的应用前景.     

商品鸡盲肠内容物乳酸菌的分离与鉴定

实验以健康商品鸡盲肠为菌源,对附着其上的乳酸菌进行分离与鉴定,就所获得的菌株的耐酸耐胆汁、黏附特性、抑菌性进行初步研究。实验结果表明,从商品鸡盲肠中分离出6株乳酸菌,根据耐酸耐胆汁试验,病原菌生长抑制试验以及肠道黏膜粘附试验,筛选出2株优势菌株CX001和CX005,经乳杆菌属的生化鉴定,初步确定为短乳杆菌。     

小鼠体内SEG蛋白靶向运送shRNA抑制狂犬病毒复制

【目的】本试验前期已经证实,用单链抗体(sc Fv)-绿脓杆菌跨膜区(ETA)-酵母DNA结合结构域(GAL4)表达的蛋白(简写为SEG蛋白),SEG能与含sh RNA(short hairpin RNA)的质粒(p RNATU6.3-sh RNA)结合形成复合物SEG-sh RNA,并靶向运送该质粒进入感染狂犬病毒(Rabies virus,RV)的细胞,抑制RV复制。本研究用感染狂犬病病毒的小鼠模型,进行SEG-sh RNA复合物小鼠体内靶向性运送si RNA(short interfering RNA)和抑制RV复制的研究。【方法】用已建立RV CVS-24株小鼠肌肉注射模型进行试验。取50 LD_(50) CVS-24攻毒,在攻毒后12 h尾静脉注射SEG-sh RNA,流式细胞仪检测SEG-sh RNA的体内靶向性;同样方法攻毒后,尾静脉注射SEG-sh RNA,连续4 d,攻毒后第5天小鼠脑组织用q RT-PCR、RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色法检测其中RV的含量;统计小鼠存活率;并检测小鼠体内IFN-α含量,从而分析SEG-sh RNA在体内的抗病毒作用。【结果】结果表明仅在RV攻毒小鼠的注射部位检测到绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达,未注射RV的腿部及脑、肝、脾、肾均无GFP表达,说明SEG-sh RNA可靶向RV感染细胞运送sh RNA。攻毒后第5天脑组织q RT-PCR结果表明靶向药物组比病毒对照减少4.88倍(3.9/0.8);RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色试验结果表明使用SEG-sh RNA组病毒量明显少于病毒对照组;且攻毒后13 d,动物存活率达50%,而病毒对照100%死亡。检测小鼠体内IFN-α未见升高。【结论】以上试验表明SEG蛋白在小鼠体内靶向运送含sh RNA的质粒到感染组织细胞;对小鼠体内RV有明显抑制作用,因此可以用于狂犬病毒感染的特异辅助性救治研究。     

水貂肠炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

根据Gen Bank登录的水貂肠炎病毒(MEV)VP2蛋白基因的保守序列设计了1对特异性引物,经PCR扩增出146bp的目的片段,并克隆到pMD 18-T载体上,提取重组质粒经PCR及测序鉴定正确后,以10倍梯度稀释质粒作为阳性标准品,绘制荧光定量标准曲线,以此建立一种基于SYBR Green荧光染料的定量PCR特异性检测水貂肠炎病毒的方法。结果表明:该方法对MEV有很好的特异性,检测灵敏度为34拷贝/μL,且重复性试验变异系数均小于2%。临床检测中,在80份样品中检测到30份阳性样品,高于普通PCR和电镜观察方法的检出率。该方法的建立实现了对MEV临床早期快速诊断和定量分析,为毛皮动物MEV的防控提供了可靠的检测方法。     

乳酸L-68型粪肠球菌对肉鸡生产性能和免疫功能的影响

目的研究乳酸L-68粪肠球菌对肉鸡的生产性能和免疫功能的影响。方法选用3000羽1日龄的艾维菌肉用仔鸡,随机分为两个处理组,每组1500羽。对照组饲喂基础日粮,实验组饲喂基础日粮并在饮水中加入微生态制剂乳酸L-68粪肠球菌,实验期为42d。通过检测平均周增重、料肉比、鸡群的健康状况、抗体水平和器官指数探索该制剂对肉鸡的促生长和免疫增强作用。结果微生态制剂实验组鸡的周增重、料肉比、抗NDV的HI效价、免疫器官指数均优于对照组鸡,差异有显著性（P〈0．05）。结论肉鸡饮水中添加乳酸L-68粪肠球菌,能促进免疫器官的生长发育,提高免疫器官指数;能明显提高循环抗体的水平,因而能促进仔鸡的生长发育,降低料肉比。     

一株水貂博卡病毒全基因组扩增及序列分析

本研究旨在研究水貂博卡病毒（Mink bocavirus,MBoV）在山东省的流行状况及基因特征。采用PCR对采自山东省境内水貂养殖场的85份水貂腹泻样品进行MBoV检测,挑选1份单阳性样品进行全基因扩增,使用MegAlign进行序列同源性比对分析,利用DNAMAN V6对基因组5’末端和3’末端回文结构进行预测,应用MEGA V6进行遗传进化分析。结果表明,所采集的腹泻样品中MBoV阳性率为3.5%(3/85),其中1份为MBoV单阳性,2份为MBoV与水貂肠炎病毒（Mink enteritis virus,MEV）双阳性。获得MBoV全基因序列1条（SDMBoV2020）,全长5 252 bp;经分析,5’-和3’-UTR分别由98和145 bp短回文序列组成,具有典型的细小病毒末端的茎环样结构;基因组含有3个ORFs,分别编码非结构蛋白NS1、NP1以及结构蛋白VP1和VP2;SDMBoV2020与NCBI登录的MBoV参考毒株KU950356各编码基因的推导氨基酸序列同源性较高,为98.5%～99.0%;基于MBoV全基因序列构建的系统发育进化树也显示,SDMBoV2020和参...