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adiponectin是脂肪细胞特异分泌的一种活性蛋白质,具有增加胰岛素敏感性、抗炎及抗动脉硬化等活性.建立adiponectin基因剔除β-半乳糖苷酶基因(LacZ)敲入小鼠模型,可为整体动物水平研究adiponectin基因功能及其表达调控机制等提供理想工具.根据生物信息学方法获得adiponectin基因组序列,设计基因剔除及敲入策略,在adiponectin基因第2和第3号外显子剔除的同时,在其ATG和信号肽序列后顺接LacZ基因完整编码序列,构建完成了Adipo-LacZ-XpPNT基因剔除质粒.通过电穿孔将打靶质粒转入ES细胞,以G418和ganciclovir进行药物筛选,获得药物抗性的ES细胞克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组克隆.将同源重组的ES细胞克隆注入小鼠囊胚得到嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配产生杂合子小鼠,杂合子间交配获得adiponectin基因剔除LacZ基因敲入纯合子小鼠.经RT-PCR、RNA印迹和ELISA检测证实纯合子小鼠脂肪和血清中adiponectin基因表达呈阴性.RT-PCR、RNA印迹及蛋白质印迹检测发现,LacZ基因在突变小鼠脂肪组织中有特异性表达,其表达谱与内源性adiponectin基因的表达谱一致.但在脂肪组织及外周血中未能检测到LacZ活性,且血清中LacZ蛋白亦呈阴性.由此成功建立了adiponectin基因完全灭活及LacZ基因以内源性adiponectin基因表达谱表达的小鼠模型,为进一步研究该基因功能及其表达调控创造了有利条件. 相似文献
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研究BPOZ基因缺失对细胞生长和分化的影响.以高浓度的G418筛选BPOZ基因杂合缺失型ES细胞,PCR鉴定抗高浓度G418细胞克隆基因型;半定量RTPCR分析3种基因型ES细胞BPOZ基因的表达情况,分析3种基因型ES细胞Oct34基因的表达以明确ES细胞分化状态.利用3种基因型ES细胞进行细胞生长曲线和3H胸嘧啶核苷参入实验比较其生长速度和增殖能力.以裸鼠荷瘤实验和类胚体形成实验比较BPOZ基因纯合缺失型ES细胞与野生型ES细胞生长分化能力.结果表明,筛选获得两个BPOZ基因剔除的纯合ES细胞克隆;筛选得到的纯合ES细胞中BPOZ基因表达完全缺失,细胞处未分化状态.与野生型ES细胞相比,BPOZ基因纯合缺失型ES细胞生长受抑,增殖能力减弱.BPOZ基因纯合缺失型ES细胞可分化形成类胚体和具备来自3个不同胚层的细胞和组织的畸胎瘤.BPOZ基因剔除使ES细胞生长受抑,对ES细胞分化发育没有明显影响. 相似文献
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