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通过RT-PCR结合RACE技术扩增到苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)吉林沙果分离物(ASGV-JLSG)全长基因组(登录号:FM616381),共含有6 496个核苷酸(nt),编码两个彼此重叠的开放阅读框(Open reading frame,ORF)。ORF1(37 ~ 6 354 nt)编码1个241 kD的多聚蛋白,含有甲基转移酶(Methyltransferase)、木瓜蛋白酶(Papain-like-protease)、解旋酶(Nucleotide triphosphate-binding helicase)、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)和C端的外壳蛋白(Coat protein,CP)等结构域。ORF2(4 788 ~ 5 750 nt)编码1个36 kD的运动蛋白(Movement protein,MP)。ASGV-JLSG分离物与GenBank公布的29个ASGV分离物全基因核苷酸序列一致性为79.20% ~ 86.60%。系统发育分析结果表明,30个ASGV分离物分成2个组,分离物间没有表现出寄主专一性和地理分布规律。重组分析发现,ASGV-JLSG分离物是苹果茎沟病毒黄花梨分离物(ASGV-HH,JN701424)和柑橘碎叶病毒满头红分离物(CTLV-MTHK,C588948)的重组体。本研究中获得的ASGV-JLSG分离物基因组是来源于中国东北地区的首个ASGV基因组序列。 相似文献
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葡萄蚕豆萎蔫病毒(grapevine fabavirus,GFabV)是近年报道的葡萄新病毒,与葡萄褪绿斑驳、皱缩等症状发生相关,严重影响葡萄长势。本研究采用小RNA测序结合Sanger测序方法分别对表现褪绿斑驳的‘贝达’和无症状的‘赤霞珠’葡萄中的GFabV分离物进行基因组全长序列测定,获得了GFabV分离物LN_BETA2和LN_CXZ的基因组全长序列,其RNA1基因组全长分别为5 824 bp和5 823 bp,RNA2基因组全长分别为3 132 bp和3 135 bp。LN_BETA2与LN_CXZ的RNA1编码的多聚蛋白核苷酸序列之间的同源性为81.7%,与其他GFabV分离物多聚蛋白核苷酸同源性分别为73.4%~99.5%和73.5%~82.5%;LN_BETA2和LN_CXZ的RNA2编码的多聚蛋白核苷酸同源性为83.8%,与其他GFabV分离物多聚蛋白核苷酸同源性为75.0%~83.3%和68.2%~98.6%。系统进化树分析结果显示,在RNA1基因组中,LN_BETA2划分在组3,LN_CXZ形成单独的分支。RNA2基因组中,LN_BETA2和LN_CXZ分别划分在组3和组5中。本研究首次报道了GFabV中国分离物基因组全长序列,可为今后GFabV生物学特性及致病性研究提供工作基础。 相似文献
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葡萄病毒E分子检测及基因序列分析 总被引:1,自引:0,他引:1
皱木复合病(rugose wood complex disease)是一种发生普遍、危害严重的葡萄病毒病,该病与葡萄病毒属(Vitivirus)病毒的侵染密切相关,葡萄病毒E(Grapevine virus E,GVE)是葡萄病毒属的新成员。为明确我国GVE侵染状况以及不同分离物的基因变异情况,本研究针对GVE的MP和CP基因设计了两对引物,RT-PCR结果表明,两对引物均能从带毒样品中扩增到目的基因片段。采用上述引物检测了211株葡萄样品,GVE检出率为5.7%。对7个GVE分离物的外壳蛋白基因进行测序和系统进化树分析,结果显示,上述分离物克隆分别处于2个明显分化的组群(Group I 和Group II)。研究测定了GVE中国分离物GFMG-1的全基因组序列,该分离物与日本分离物TvAQ7核苷酸序列相似度高达98%,但与日本分离物TvP15、南非分离物SA94、美国分离物WAHH2及波兰分离物59PE核苷酸序列相似性仅为70%~75%。本研究为进一步明确我国GVE发生、分布及分子检测提供了依据。 相似文献
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葡萄病毒B Grapevine virus B(GVB)是葡萄皱木复合病中栓皮病的病原,为开展抗GVB转基因研究,本研究利用RT-PCR技术克隆GVB外壳蛋白(coat protein,CP)基因,与植物表达载体pRI 101-AN连接构建植物表达载体pRI-GVB CP。采用电击转化法将植物表达载体pRI-GVB CP导入农杆菌LBA4404,并利用农杆菌介导的叶盘转化法将外源基因导入西方烟‘37B’。共获得16个烟草再生株系,PCR检测其中3个株系为阳性,阳性株系播种获得的64株T_1代植株中有30株扩增到目的条带,阳性率为46.9%,表明目的基因GVB cp成功导入烟草并可成功遗传到子代。28株T_1代转基因植株接种病毒进行抗病性鉴定,其中有6株对接种病毒GVB具有抗性。 相似文献
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葡萄扇叶病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引:1,自引:0,他引:1
根据葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus,GFLV)RNA2序列设计4对特异性引物,通过引物筛选、体系优化,建立了以FL-HP1-F/R为引物的GFLV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。该方法标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为100%,相关性系数为0.998,灵敏性分别是常规RT-PCR和巢式RT-PCR的100倍和10倍。重复性试验表明组内和组间变异系数均小于2.59%,显示该方法具有较好的检测稳定性。内参基因的稳定性测试结果表明葡萄EF1和GAPDH基因具有较好的试验稳定性。利用建立的荧光定量方法测定12个葡萄样品中GFLV含量,并检测58个葡萄样品,结果表明不同葡萄样品中GFLV含量差异较大,最高含量是最低含量的81 245.5倍,与ELISA和巢式RT-PCR相比,实时荧光定量方法能检测出更多的GFLV分离物。 相似文献
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灰比诺葡萄病毒(Grapevine Pinot gris virus, GPGV)是国内新近报道的葡萄病毒,能引起葡萄叶片褪绿斑驳、皱缩及变形等症状,严重影响葡萄长势。为明确我国GPGV的发生及基因序列变异情况,本研究采用RT-PCR方法对采自我国15个省(市)自治区的195个葡萄样品进行检测,其中55个葡萄样品检测出GPGV。对49个GPGV阳性分离物的外壳蛋白(coat protein, cp)和运动蛋白(movement protein, mp)基因进行克隆、测序, 序列分析结果显示:来源于国内外的GPGV分离物cp基因和mp基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为85.30%~100%和95.00%~100%、85.73%~99.87%和95.58%~100%。基于cp和mp基因序列构建的进化树,将GPGV分离物划分为3个明显的组群。其中,大部分GPGV分离物被划分在组群1内,其它中国GPGV分离物形成2个新的组群2和3。本研究是关于中国GPGV分离物基因序列变异的初次报道,可为进一步开展GPGV分子检测的技术研发及不同变种的致病性研究提供依据。 相似文献
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采用RT-PCR和RACE技术,克隆了李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)辽宁桃树分离物全长基因组。用Vector NTI Advance 11软件进行基因组结构注释。用SDTv.1.0软件分析该分离物与Gen Bank中公布的其他PNRSV分离物间的核酸一致性,并用MEGA5.0软件和RDP3软件对各PNRSV分离物进行系统发育分析和重组分析。结果显示:PNRSV辽宁桃树分离物基因组由3条正义单链RNA组成。RNA1由3 332个核苷酸构成,具有一个开放阅读框(nt 30~3 167),编码一个约117.0k D的复制酶相关蛋白P1。RNA2由2 591个核苷酸构成,具有一个开放阅读框(nt 27~2 426),编码一个约99.0 k D的复制酶相关蛋白P2。RNA3由1 943个核苷酸构成,具有两个互不重叠的开放阅读框分别编码一个运动蛋白(nt 175~1 026)和一个外壳蛋白(nt 1 100~1 774),这两个开放阅读框的间隔区为73个核苷酸。PNRSV辽宁桃树分离物的RNA1、RNA2和RNA3与其他已经公布的PNRSV分离物间,核酸序列一致性分别为91.8%~98.8%,93.3%~99.2%和87.7%~99.0%。基于RNA1、RNA2和RNA3全长序列构建的系统发育进化树,分别将已报道的PNRSV分离物划分为3个、2个和3个组,PNRSV辽宁桃树分离物分别属于RNA1Ⅰ组、RNA2Ⅰ组和PV96组。基于RNA1、RNA2和RNA3全长序列进行的重组分析表明各PNRSV分离物基因组间不存在重组。PNRSV辽宁桃树分离物基因组序列是世界首个来源于桃树的PV96组基因组序列。 相似文献
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葡萄试管苗热处理脱毒技术研究 总被引:2,自引:0,他引:2
为加快培育葡萄优良品种无病毒苗木,提高脱毒效率,开展了葡萄试管苗热处理脱毒技术研究。将携带葡萄扇叶病毒(GFLV)、葡萄斑点病毒(GFkV)、沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)、葡萄卷叶相关病毒-1(GLRaV-1)和葡萄卷叶相关病毒-2(GLRaV-2)的8个葡萄品种试管苗进行恒温热处理,对分离成活的62个茎尖进行RT-PCR和ELISA检测。结果显示,62个茎尖中,29个茎尖脱除了上述5种病毒,葡萄卷叶相关病毒-1、葡萄斑点病毒、葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶相关病毒-2和沙地葡萄茎痘病毒的脱毒率分别为81.8%、80.0%、78.1%、75.0%和61.5%。采用试管苗热处理结合茎尖培养方法可获得良好的脱毒效果,适用于葡萄无病毒原种母本树的培育。 相似文献
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