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应用PCR技术从人胎肺cDNA文库中扩增tumstatin基因编码序列,克隆至pET-3c载体构建非融合表达的重组质粒pET-3c-tum,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得高效表达.表达蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、切胶回收后免疫新西兰大白兔,获得ELISA效价高达1∶1 000的特异性兔抗人tumstatin抗血清. 相似文献
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利用枯草杆菌整合表达嗜铬粒蛋白抗真菌片段 总被引:4,自引:0,他引:4
为实现CGA1-76片段基因在枯草杆菌中的稳定表达,将CGA1-76片段基因的表达元件重组到枯草杆菌转座子质粒pHV1249微转座子mini-Tn10内,利用mini-Tn10将CGA1-76片段基因的表达元件整合到枯草杆菌DB1342染色体上,用氯霉素和红霉素筛选枯草杆菌转座工程菌DB1342(TnSVTQ).DB1342(TnSVTQ)在无选择压力条件下经10 d连续传代培养,转座子内氯霉素抗性丢失率为0%,说明转座子稳定整合在DB1342染色体上.SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明,在蔗糖诱导下,CGA1-76片段基因在DB1342(TnSVTQ)中获得表达,产物被分泌到细胞外.孔穴琼脂扩散法测定表达上清的抑制真菌活性,结果表明重组CGA1-76能抑制烟曲霉菌和黄曲霉菌的生长,抑菌圈直径分别为9 mm和8 mm. 相似文献
3.
从污染环境中分离出一株抗100μM HgCl_2的假单胞菌B-33.经试验证实,假单胞菌B-33具有汞盐抗性质粒,定名为pBH33质粒,其分子量约为7.24×10~6道尔顿. 相似文献
4.
本文采用我国自己分离的短小芽孢杆菌抗四环素质粒pCJ3转化枯草杆菌的各种突变体.质粒DNA经氯化铯—溴化乙锭密度梯度离心纯化后转化枯草杆菌的感受态细胞.结果表明枯草杆菌BR151,SB202,168,QB1130及QB1133都可作为质粒pCJ3的受体,转化效率在10~3左右,其中以SB202这株突变体为最高,从各种转化体中提取的质粒及经BamHI消化后的质粒的电泳图均与原质粒pCJ3及其BamHI酶切片段相同,并具有pCJ3的抗四环素转化活性.将pCJ3DNA经BamHI酶切后重新用T_4-DNA连接酶连接再转化枯草杆菌细胞,其转化效率比原质粒高1—2个数量级.研究了二价金属离子、pH及培养基成分对转化的影响,结果证明:Ca~(++)对枯草杆菌转化有促进作用,Cu~(++),Zn~(++)则有抑制作用,转化的最适pH在7.2—7.5之间;营养丰富培养能提高转化效率. 相似文献
5.
Pichia pastoris是近年来迅速发展的一种真核生物表达宿主,有着广阔的应用前景.本文从提高Ppastoris表达重组蛋白产量的角度,就启动子、高拷贝重组子、密码子偏爱、宿主菌和高密度发酵等方面的优化进行了综述. 相似文献
6.
枯草杆菌诱导型高效表达-分泌系统的构建 总被引:4,自引:0,他引:4
利用枯草杆菌蛋白酶缺陷突变株,sacB诱导基因及degQ,degU(Hy)正调控基因构建了诱导型表达-分泌系统以解决枯草杆菌分泌大量胞外蛋白酶和外源基因表达水平不高的问题.采用共转化方法将枯草杆菌IA95的degU(Hy)突变引入枯草杆菌蛋白酶缺陷突变株DB403,获得degU(Hy)和蛋白酶三缺陷的新菌株DB1342;利用sacB基因的启动子--信号序列及芽孢杆菌的两个正调控基因degQ和degU(Hy)构建了诱导型表达-分泌载体pURT3及pURTQ4,由DB1342突变株及pURT3及pURTQ4载体组成枯草杆菌诱导型高效表达和分泌系统.在本系统中内源基因sacB的表达量是原菌株DB403的296倍,将地衣杆菌α-淀粉酶基因引入本系统后在sacB,degQ,degU的调控和蔗糖的诱导下,α-淀粉酶的表达量是在DB403中的140倍,证实degQ及degU对基因表达的增强作用是叠加的. 相似文献
7.
从短小芽孢杆菌A3菌株分离的具四环素抗性质粒pCJ3,经电泳法及氯化铯密度梯度法纯化后在琼脂糖凝胶电泳上得到2条带,经电镜观察及限制酶切割证实是一种质粒的两种构型——超线团及开环DNA分子。纯化质粒用13种限制酶进行酶切试验,发现其中有BamH I、Ava I、Xba I切点1个,EcoR I、Pst I、Bgl I、Hinc Ⅱ及Xho I切点2个、Hinf I、Sal I及Bel I切点3个,Hha I切点5个,Hind Ⅲ没有切点。用BamH I、EcoR I、Ava I及Xba I进行双酶解,并根据双酶解后的琼脂糖凝胶电泳带估算出各个片段的分子量,作出质粒pCJ3的4种限制酶的酶切图谱。 相似文献
8.
黑曲霉葡萄糖淀粉酶cDNA的克隆和序列分析及其在大肠杆菌中的表达(英文) 总被引:1,自引:0,他引:1
以poly(A)~ mRNA为模板,噬菌体λgt 10 DNA为载体构建了黑曲霉3758的cDNA的文库。用编码黑曲霉葡萄糖淀粉酶329—418位氨基酸的DNA顺序(456bp)作探针从该文库中筛选葡萄糖淀粉酶cDNA。采用原位噬菌斑杂交法获得11个阳性噬菌斑,从其中6个噬菌体中提取DNA进行限制酶切分析和印迹法转移杂交试验,发现这些阳性噬菌体DNA含有不同大小的插入片段,它们都能与DNA探针杂交,表明已克隆了葡萄糖淀粉酶的cDNA。采用单酶切及交叉双酶切法制定了2.1kbcDNA的物理图并对2.1kb片段作了全序列分析。序列分析结果显示,克隆的2.1kb片段含5'端非编码区,编码葡萄糖淀粉酶的结构基因及3'端非编码区。克隆的cDNA片段转移至表达载体λgt11,感染大肠杆菌后,产生的噬菌斑转移硝酸纤维素滤膜后与~(125)I标记的抗葡萄糖淀粉酶抗体进行免疫反应,结果证明含2.1kbcDNA的λgt11表现葡萄糖淀粉酶阳性.2.1kb片段也曾转至质粒pPL2,转化大肠杆菌JF1125。细胞裂解物在SDS-PAGE电泳中可看到新的蛋白带。这些结果表明,克隆的黑曲霉葡萄糖淀粉酶cDNA可以在大肠杆菌中表达。 相似文献
10.
改进的鸡胚绒毛尿囊膜技术--无气室孵育法 总被引:20,自引:0,他引:20
对传统的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)方法进行改进。将孵育6d的鸡胚去掉气室后,将待测样品加入到CAM上,用无菌透明胶封口,继续孵育2—3d,去掉封口暴露CAM,用甲醇/丙酮等体积混合液室温固定10min后进行观察,结果鸡胚血管网完好无损,样品作用效果显示明显,表明该方法相对于传统方法而言,具有操作简单,鸡胚存活率高,样品效果显示更直观等优点。 相似文献