产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选及酶学特性的研究

普鲁兰降解酶(pullulan degrading enzymes)能够专一水解普鲁兰多糖α-1,6-糖苷键以及特定位置的α-1,4-糖苷键,在工业、食品业、医疗保健等行业中具有重要的应用意义.本研究采用唯一碳源法从稻田土样中培养筛选到21株产普鲁兰降解酶的菌株.对菌株A1的鉴定及其产生的普鲁兰降解酶的分析表明,该菌株为气单胞菌属,其产生的酶属于Ⅰ型普鲁兰酶(Type I pullulanase,EC 3.2.1.41),专一水解普鲁兰多糖α-1,6-糖苷键.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.0,具有良好的温度稳定性和适应性;同时在pH为4.0时仍然保留50%的酶活.进一步对A1菌株产酶的发酵条件(pH、温度、时间)进行了优化,摇瓶中A1分泌表达Ⅰ型普鲁兰酶的水平达到21.2 U/mL.根据已报道的气单胞菌属普鲁兰酶基因的保守序列设计引物,克隆获得了4 053 bp的A1普鲁兰酶基因pluA1全长序列,编码1351个氨基酸.本研究结果为该酶的开发应用奠定了基础.     

内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的高水平表达研究

低聚果糖(Fructooligosaccharides,FOS)具有改善胃肠道环境、刺激和加强机体免疫反应、抑制肠道特定肿瘤的发生等生物活性.内切菊粉酶能够水解菊粉获得低聚果糖.为了实现内切菊粉酶的高表达,从无花果曲霉(Aspergillus ficuum ATCC16882)中克隆了内切菊粉酶编码基因INU2,并实现了在毕赤氏酵母中的重组分泌表达,摇瓶表达的酶活力为570.4U/mL.去除内切菊粉酶的内源性信号肽序列后,其重组表达水平显著提高,摇瓶表达的酶活力为1013.8U/mL,提高幅度77.7%.TLC分析表明:毕赤酵母重组表达的内切菊粉酶(不含内源性信号肽序列)能将2%长链菊粉水解为2～3个聚合度的低聚果糖.