缺氧诱导因子-1抵抗缺氧诱导的肿瘤细胞凋亡

目的 通过对结肠癌SW480细胞中缺氧诱导因子-1(HIF-1)的有效干扰,观察沉默HIF-1后对肿瘤细胞缺氧环境下凋亡的影响.方法 以三气培养箱诱导缺氧环境,pGenesil-11 质粒为载体转染SW480细胞沉默HIF-1.透射电镜观测肿瘤细胞的形态学变化;荧光染料Hoechst 33258、DNA Ladder检测细胞凋亡.结果 与第3天(0.19±0.02)、第15天(0.20±0.03)比较,第7天(0.16±0.02)时RNA干扰效果最好(P<0.05).RNA阳性干扰组结肠癌SW480细胞:电镜下可见凋亡小体形成等形态学变化;细胞凋亡荧光检测,染色呈强蓝色荧光,并可见核碎裂;DNA Ladder检测出现细胞凋亡时典型的梯状条带.结论 HIF-1具有对抗缺氧诱导的肿瘤细胞凋亡的作用.     

VEGF上调不同类型细胞Survivin的表达

目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF）对结肠癌细胞（LOVO、HCT116）、人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）Survivin表达的影响和存在的差异。方法 VEGF刺激体外培养的LOVO、HCT116、HUVECs并检测细胞周期和凋亡的变化,用RT－PCR测定mRNA表达,Western blot测定蛋白表达,用免疫细胞化学测定Survivin蛋白表达和部位。结果 VEGF可促进肿瘤细胞增殖,在结肠癌细胞中Survivin表达水平较高,在VEGF诱导后表达上调（P<0.05）,主要分布在细胞质;在HUVECs中,Survivin表达不明显,VEGF诱导后表达明显上调（P<0.05）,在细胞质和细胞核中均有较高表达。结论 VEGF上调3种细胞Survivin mRNA和蛋白表达,但在肿瘤和非肿瘤细胞Survivin上调的程度和分布存在差异。     

Survivin基因的shRNA 干扰对结肠癌SW480 细胞增殖和凋亡的影响*

目的：以携带shRNA 片段的腺病毒为载体,对结肠癌细胞SW480 中Survivin基因的表达进行干扰,研究其对肿瘤细胞中Survivin基因沉默效果及对细胞周期、凋亡和增殖的影响。方法：将构建好的携带Survivin-shRNA 片段腺病毒,体外转染结肠癌细胞株SW480。以EGFP为报告基因,采用流式细胞计数测定不同感染复数（MOI）下的转染效率,选取适当病毒浓度进行下一步实验。通过RT-PCR 和Western blot检测基因沉默后结肠癌细胞内Survivin mRNA和蛋白的表达水平;在Annexin V-FITC 和PI染色后通过流式细胞术检测并分析Survivin基因沉默后细胞周期和凋亡的变化;同时采用噻唑蓝（MTT）法、克隆增殖实验对细胞不同时期增殖活性进行观察,明确对细胞增殖的抑制时效性。结果：腺病毒转染后MOI 值在0～50时,剂量与转染效率成正比,确定最佳MOI 值为50并进行后续实验;shRNA 干扰后细胞内Survivin mRNA和蛋白表达水平降低,较对照细胞组差异有统计学意义（P<0.01）。 流式细胞仪检测结果显示基因沉默后细胞凋亡率升高,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。 同时基因沉默后,细胞周期也有明显变化,表现为G1/S 期细胞增多和G2/M期细胞减少,与对照细胞组相比差异有统计学意义（P<0.05）。 MTT 和单克隆平板实验均显示Survivin基因的沉默,对细胞的增殖和生长均具有明显抑制作用（P<0.05）。 结论：采用腺病毒对结肠癌进行靶向Survivin基因的shRNA 干扰,能有效降低目的基因的表达。其介导的Survivin基因的沉默,可以有效的诱导结肠癌细胞凋亡,同时Survivin基因可以通过抑制细胞G1/S 期转化来阻止细胞分裂,抑制细胞生长。