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目的 探索如何抑制嗜酸细胞的趋化作用,选择β-趋化因子巨噬细胞炎性蛋白4(MIP4)的突变性(Met-MIP4)作为趋化因子受体3的拮抗剂,将Met-MIP4基因在原核细胞中进行表达。方法 设计MIP4基因的PCR引物并进行氨基酸突变,将MIP4N末端的丙氨酸突变为蛋氨酸,以正常人肺酸突变,将MIP4N末端的丙氨酸突变为蛋氨酸。以正常人肺cDNA文库为模板,PCR方法获取Met-MIP4基因,克隆入载体pUC19,测序验证序列已得到突变,将正确的基因插入到GST融合表达载体pGEX-4T中,以IPTG诱导表达。结果 PCR产物为220bp左右的片段,连接入pUC19质粒后测序验证获得正确突变,构建的pGEX-4T融合表达载体在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE凝胶电泳显示有大小约34kU的新生融合蛋白表达。结论 成功突变并克隆了β-趋化因子MIP4基因,SDS-PAGE表明,与GST融合的Met-MIP4突变体已得到表达,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。 相似文献
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肿瘤坏死因子新型免疫抑制剂的构建、表达和鉴定 总被引:1,自引:2,他引:1
目的 用鸡卵清溶菌酶(Hen egg-white lysozyme,HEL)T辅助细胞表位序列替换hTNF-α3^ 末端序列,构建和表达hTNF-α新型免疫抑制剂。方法 将重组的hTNF-α HEL克隆、表达、纯化后进行初步的生物学活性鉴定。结果 DNA测序分析表明,重组的hTNF-α HEL3^ 末端序列与设计序列完全相同。将其插入pBV220表达载体中,重组菌经42℃诱导4h做SDS-PAGE分析,结果 显示该免疫抑制剂获得了表达,Mt为17000,其表达量为菌体总蛋白量的30%。Western blot结果证实,该表达蛋白可与抗TNF-α抗体产生免疫反应。对该表达蛋白进行了阴离子交换柱纯化,获得的重组蛋白的纯度可达95%以上。对该蛋白的体外杀伤活性检测表明,该蛋白已完全丧失了TNF-α的体外杀伤活性。结论 上述实验结果证明,TNF-α免疫抑制剂的构建获得了成功,该免疫抑制剂既保持了与TNF-α抗体结合的能力又失去了TNF-α的杀伤活性,为其下一步治疗作用的研究奠定了基础。 相似文献
3.
GM-CSF对MUC1基因疫苗抑制乳腺癌生长的增强作用 总被引:5,自引:2,他引:5
目的 :观察GM CSF有无增强MUC1基因疫苗对EMT6乳腺癌生长的特异性抑制作用。方法 :采用股四头肌肌肉注射法 ,将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1 MUC1免疫雌性BALB/c小鼠 ,每 3wk 1次 ,共 3次。每次基因免疫后 1、3、5d ,皮下注射GM CSF 10 0 μL(1μg/ 10 0 μL)。最后 1次基因免疫后第 3周 ,接种表达MUC1的EMT6小鼠乳腺癌细胞。两周后观察、记录肿瘤的生长情况。于肿瘤细胞接种后第 4 3天 ,处死全部动物 ,称量肿瘤的质量。用 4h51Cr释放法检测小鼠脾特异性CTL的杀伤活性。结果 :接种肿瘤细胞后 4 3d ,MUC1基因疫苗加GM CSF组、MUC1基因疫苗组、pcDNA3.1加GM CSF组及pcDNA3.1组 ,EMT6肿瘤的大小依次为 (135± 33.8)mm3 、(2 5 0± 34.3)mm3 、(5 6 8± 4 3.6 )mm3 和 (5 96± 4 8.2 )mm3 ;平均瘤质量 (g)依次为 (0 .81± 0 .4 2 )g、(1.2 3± 0 .4 1)g、(2 .30± 0 .4 8)g及 (2 .2 8± 0 .5 8)g。与对照组相比较 ,MUC1基因疫苗组EMT6肿瘤的生长受到明显抑制 (P <0 .0 5 ) ;与单独MUC1基因疫苗组相比较 ,MUC1基因疫苗加GM CSF组抗肿瘤生长的作用有显著差异 (P <0 .0 5 )。在效靶比为 10 0∶1、5 0∶1、2 5∶1和 12 .5∶1时 ,MUC1基因疫苗加GM CSF组特异性CTL对EMT6靶细胞的杀伤率 ,依次为 6 8.5 %、 5 3.4 % 相似文献
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将合成的含有随机序列 (NNK) 1 0 的寡核苷酸片段 ,克隆入噬菌体呈现载体噬菌粒 p CANTAB5 E的 Sfi ,N ot 位点 ,即 cp 蛋白信号肽与成熟肽之间 ,电转化 E.coli TG1,构建了噬菌体表面呈现的十肽库 ,实际库容为 3.5 3× 10 7,插入率为 6 6 .7% .经辅助噬菌体 M13KO7超感染后 ,获得滴度为 4.8× 10 1 1 pfu/ m l的噬菌体上清 .经过两轮 panning筛选和富集 ,从构建的随机十肽库中筛选到 2 6个具有血管形成素结合活性的重组噬菌体克隆 ,对其中 12个阳性噬菌体克隆的短肽序列进行了分析 ,EL ISA检测结果显示 12个阳性噬菌体克隆都能够… 相似文献
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[范彬,张英起,赵宁,颜真,药立波,苏成芝.细胞与分子免疫学杂志,2001;17(1):29-31]]目的 在原核细胞中表达融合蛋白hTNFα-hPgnK5并鉴定其活性.方法 构建hTNFα-hPgnK5基因的表达载体,并在大肠杆菌DH5α中进行表达.以MTT法测定该融合蛋白体外抑制肿瘤细胞或血管内皮细胞增殖的活性.结果 成功地构建了hTNFα-hPgnK5表达载体并获得表达.免疫印迹分析表明,该融合蛋白具有hPgnK5的免疫活性.体外实验表明,该融合蛋白具有抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞增殖的活性.结论 hPgnK5蛋白可与hTNFα共同表达,表达产物可抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞增殖. 相似文献
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0 引言 白蛋白和甘露醇是生产IL-2冻干粉针剂时常用的赋形剂,其目的是保持制剂的生物活性和制剂性状,提高产品的稳定性,并且容易进行冷冻干燥和利于贮藏及运输.我们在实验中利用不同浓度的两种赋形剂生产IL-2冻干制剂,通过检测IL-2的活性,对制剂中白蛋白和甘露醇的保护作用进行比较,以评价该产品的冻干工艺.1 材料和方法1.1 材料 RPMI1640为美国Gibco公司生产.小牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所生产.3H-TdR购于中国科学院上海原子核研究所.IL-2标准品为中国药品生物制品检定所出品.液体闪烁计数仪(LS-6500,美国Beckman公… 相似文献
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0 引言 胸腺素 α1(Thymosin alpha1,Tα1)是从胸腺素组分 5 (TF5 )中分离纯化出的热稳定酸性多肽 [1 ] ,由 2 8个氨基酸组成 ,Mr为 310 8.它是一种具有多种生物学活性的免疫调节剂 ,已应用于治疗乙肝、丙肝、癌症和免疫缺陷的研究中 .虽然胸腺素 α1有着广泛的应用前景 ,但由于其基因过短 ,很难利用基因工程方法实现直接表达 ,所以目前多是化学合成产品 [2 ] ,价格比较昂贵 ,应用的推广受到限制 .为了探索胸腺素α1多聚体的可能的生物学活性及其基因的体外表达 ,我们利用随机退火与 PCR技术相结合的方法构建了胸腺素α1的多串体基因 … 相似文献
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人纤溶酶原饼环区5基因的化学合成与原核载体的构建 总被引:3,自引:0,他引:3
0 引言 抑制肿瘤新生血管生长可以抑制肿瘤生长 ,这是目前肿瘤治疗中新发展的治疗途径 .血管生长抑制因子是由纤溶酶原中的前四个饼环区构成的 ,具有抑制肿瘤新生血管进而达到抑制肿瘤的作用 [1 ] .研究表明 ,纤溶酶原饼环区 5 (简称 K5 ,下同 ) ,具有比血管生长抑制因子更佳的抑制肿瘤新生血管生长的作用 [2 ] .我们将人工合成的人纤溶酶原 K5 基因的 8段核酸片段组成为一个完整的 K5 基因 ,并连入原核载体中获得成功 .1 材料和方法1 .1 材料 p GEM3zf(- )质粒 ,JM1 0 9菌种由本室保存 ,T4多核苷酸激酶为 MBI公司产品 ,Bam HI,… 相似文献
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