基于网络药理学和实验验证探讨肉苁蓉防治癌因性疲劳的作用机制研究北大核心CSCD

网络药理学结合体内外实验探究肉苁蓉治疗癌因性疲劳(cancer-related fatigue,CRF)的作用机制,为临床用药提供理论依据。采用中药系统药理学数据库(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)平台检索肉苁蓉中的化学成分和中药靶点,利用GeneCards数据库和NCBI数据库筛选CRF疾病的作用靶点,取中药与疾病的共同靶点,构建蛋白互作(PPI)网络,进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,构建可视化的中药-疾病靶点相关的信号通路;建立紫杉醇(paclitaxel,PTX)诱导的CRF小鼠模型,分为对照组,PTX组,肉苁蓉提取物250、500 mg·kg^(-1)组,旷场、悬尾实验及力竭游泳时间评价小鼠抗CRF作用,苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色评价小鼠骨骼肌的病理形态;构建用C26共培养诱导的C2C12肌肉细胞癌性恶病质模型,分为对照组、条件培养液模型组及肉苁蓉提取物62.5、125、250μg·mL^(-1)组,流式细胞仪检测各组细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,透射电镜评价各组细胞内线粒体状态,Western blot法检测各组细胞中低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、BNIP3L及Beclin-1蛋白的表达水平。结果从肉苁蓉中筛选出6个有效成分,肉苁蓉治疗CRF的核心基因有AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、JUN、EGFR、MYC、EGF、MAPK1、PTGS2、MMP9、IL-1B、FOS以及IL-10等;与肉苁蓉治疗CRF相关的通路有AGE-RAGE、HIF-1等信号通路;通过GO富集分析发现主要涉及的生物功能有脂质过氧化、营养缺乏、化学应激、氧化应激以及氧气含量等生物过程;体内实验结果表明,肉苁蓉提取物可以显著改善小鼠骨骼肌萎缩,缓解CRF;体外实验结果表明,肉苁蓉提取物可以显著降低胞内ROS的含量、线粒体碎裂百分率及Beclin-1蛋白表达水平,增加自噬小体数目、HIF-1α和BNIP3L蛋白表达。肉苁蓉显示出良好的抗CRF作用,其机制可能与HIF-1α信号通路关键靶蛋白相关。     

肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对大鼠肝星状细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的：研究肉苁蓉苯乙醇总苷（CPhGs）脂质体对大鼠肝星状细胞（HSCs）增殖、凋亡、周期的影响及其相关分子机制。方法：HSCs分为空白对照组和CPhGs脂质体低、中、高浓度（分别为7.36、14.72、29.45 μg/mL）处理组。采用MTT法检测CPhGs脂质体对大鼠肝星状细胞增殖的影响;流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡状况,PI染色法检测大鼠肝星状细胞的周期变化;Western blot检测caspase-3、p27蛋白的表达变化。结果：与空白对照组比较,低、中、高3个剂量的CPhGs脂质体作用于HSCs后,均可抑制细胞的增殖（P < 0.05）;3个剂量的CPhGs脂质体均可促使大鼠肝星状细胞发生凋亡,使细胞阻滞在G0/G1期,上调caspase-3及p27蛋白的表达（P < 0.05）。结论：CPhGs脂质体对体外培养大鼠肝星状细胞有抑制增殖、促进凋亡、阻滞细胞周期的作用。其机制可能与CPhGs脂质体上调caspase-3和p27蛋白表达有关。     

肉苁蓉苯乙醇苷类成分对BSA诱导的肝纤维化大鼠转化生长因子β1表达的影响

目的:观察肉苁蓉苯乙醇苷类成分(CPhGs)对牛血清白蛋白(BSA)诱导的免疫性肝纤维化大鼠肝组织转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响,探讨其治疗肝纤维化的效果及机制。方法:将75只SD大鼠随机分为6组,即正常对照组,肝纤维化模型组,阳性对照组(复方鳖甲软肝片600 mg/kg),以及CPhGs高(500 mg/kg)、中(250 mg/kg)、低(125 mg/kg)剂量组。CPhGs高、中、低剂量组每组各13只,其余每组各12只。采用皮下及尾静脉注射BSA诱导建立大鼠肝纤维化模型,造模同时灌服相应剂量的受试药物,正常对照组和模型组灌胃给予蒸馏水,其余各组均按设定剂量灌胃给药;给药结束后收集大鼠血清、肝组织,采用全自动生化仪检测大鼠肝功能酶指标,包括血清白蛋白(ALB)、血清总胆红素(TB)、血清直接胆红素(DB)水平;放射免疫法检测血清肝纤维化标志包括血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC Ⅲ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)含量;ELISA测定血清TGF-β1水平;Masson染色观察肝脏病理组织学变化;免疫组化法测定肝组织中TGF-β1的表达。结果:与模型组相比,CPhGs各剂量组肝纤维化大鼠血清中ALB含量增加,中、高剂量组TB、DB含量降低,各剂量组大鼠肝纤维化指标含量均明显降低(P<0.05或P<0.01),血清TGF-β1含量降低(P<0.01),Masson染色结果显示CPhGs各剂量组肝纤维化程度减轻,均显著低于模型组(P<0.01),各剂量组肝组织中TGF-β1蛋白的表达也明显受到抑制(P<0.05或P<0.01)。结论:CPhGs对BSA诱导的免疫性肝纤维化大鼠具有较好的保护作用,对TGF-β1表达的抑制作用可能是其作用机制之一。     

肉苁蓉苯乙醇总苷对大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smad信号通路表达的影响

目的：探讨肉苁蓉苯乙醇总苷（CPhGs）对转化生长因子β1（TGF-β1）介导的大鼠肝星状细胞（HSC-T6）增殖活化作用及对TGF-β1/Smad信号通路表达的影响。方法：试验分为正常对照组、5 ng/mL TGF-β1刺激的HSC-T6模型组、5 ng/mL TGF-β1+不同终浓度（25、50、75和100 μg/mL）CPhGs给药组,另设只加DMEM培养液的空白组。体外培养HSC-T6细胞,通过四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测细胞的增殖;LDH比色法测定CPhGs的细胞毒性;采用荧光定量PCR（qPCR）检测Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达;采用Western blot法检测Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad7蛋白的表达。结果：与正常对照组比较,TGF-β1模型组显著促进了HSC-T6细胞的增殖,而50~100 μg/mL的CPhGs可以抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖（P<0.05）,且25~100 μg/mL的CPhGs对HSC-T6无明显细胞毒性作用;25~100 μg/mL CPhGs均可抑制Smad2和Smad3 mRNA和蛋白水平的表达,且明显抑制Smad2和Smad3蛋白的磷酸化水平,促进Smad7 mRNA和蛋白的表达,差异均具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论：CPhGs的抗肝纤维化作用可能与其阻断TGF-β1/Smad通路进而阻断HSC-T6细胞的活化和增殖有关。     

ECE1过表达通过eNOS/NO通路促进AngⅡ诱导的体外培养大鼠心肌细胞肥大和凋亡

目的:探讨过表达内皮素转换酶1(ECE1)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的体外培养大鼠H9C2心肌细胞肥大和凋亡的影响.方法:采用AngⅡ作用于体外培养的H9C2心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型.将细胞分为空白对照组、AngⅡ组、AngⅡ+质粒空载体(AngⅡ+NC)组和AngⅡ+ECE1过表达组.CCK-8法检测细胞活...     

ECE-1基因去甲基化在腹主动脉缩窄术后左室肥厚大鼠中的作用及机制研究

目的：探讨内皮素转换酶1（ECE-1）基因去甲基化在腹主动脉缩窄术（AAC）左室肥厚大鼠中的作用，及对磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/PKB）信号通路的影响。方法：雄性SD大鼠30只，随机分为3组：空白组、模型组和假手术组，每组10只。模型组采用腹主动脉缩窄术建立压力超负荷心肌肥厚模型，假手术组分离腹主动脉但不结扎。6周后，超声心动图检测左室舒张末内径（LVED）、左室舒张末后壁厚度（LVPWT）、射血分数（EF）、短轴收缩率（FS），称重计算心脏质量指数（HWI），HE染色观察心肌细胞面积（AMC），甲基化特异性PCR检测心肌ECE-1基因去甲基化水平的变化，实时荧光定量PCR检测心房利钠肽（ANP）、ECE-1 mRNA表达变化，ELISA检测血浆内皮素1（ET-1）水平，Western blot检测p-PI3K、PI3K、p-PKB、PKB蛋白表达变化。结果：假手术组大鼠LVPWT、LVED、EF、FS、HWI、AMC、ANP和ECE-1 mRNA、ECE-1基因去甲基化水平以及p-PI3K、p-PKB蛋白水平与对照组无明显差异。与假手术组相比，模型组大鼠LVPWT、HWI、AMC增大，心肌组织ECE-1基因去甲基化水平升高，ECE-1和ANP mRNA表达上调，血浆ET-1水平上升（P < 0.01），LVED、EF、FS减小，心肌组织p-PI3K、p-PKB蛋白表达下调（P < 0.01或P < 0.05）。结论：ECE-1基因去甲基化可能参与了压力超负荷大鼠心肌肥厚的形成过程，该过程可能与PI3K/PKB信号通路的抑制有关。     

肉苁蓉苯乙醇总苷对压力超负荷大鼠心肌肥厚及PI3K/PKB信号通路的影响

目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)对压力超负荷大鼠心肌肥厚的抑制作用及其可能的作用机制。方法♂SPF级SD大鼠70只,随机分为空白组(Con)、假手术组(Sham)、模型组(Mod)、阳性药对照组(Vst)、CPhGs 125、250、500 mg·kg^-1组。检测心脏超声指标、心脏体质量指数(HWI)、心肌组织病理学变化、心肌细胞面积(AMC),Elisa法检测血浆ET-1、BNP水平,Western blot法检测p-PI3K、PI3K、p-PKB、PKB蛋白表达变化。结果与Mod组相比,CPhGs不同剂量给药后,LVPWT、HWI、血浆ET-1和BNP、AMC均有不同程度下降,LVEDD、LVEF、LVFS以及心肌组织p-PI3K、p-PKB蛋白表达有不同程度的增加,其中CPhGs 250、500 mg·kg^-1组相比于Mod组各指标有明显差异(P<0.05或0.01);与Vst组相比,CPhGs 500 mg·kg^-1组各指标,没有明显差异。结论CPhGs对压力超负荷引起的大鼠心肌肥厚具有抑制作用,其作用可能与PI3K/PKB信号通路的激活有关。     

毛蕊花糖苷对血小板衍生生长因子BB处理后大鼠肝星状细胞的影响

目的：探讨毛蕊花糖苷对血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）诱导的大鼠肝星状细胞（HSC）活化、迁移、胶原沉积、纤维化作用的影响,并进一步探讨其对ERK1/2、Akt信号通路表达的影响。方法：HSC细胞分为毛蕊花糖苷（1.5、3.0、6.0 mg/L）组[重组大鼠PDGF-BB（rrPDGF-BB）预处理24 h后,不同浓度的毛蕊花糖苷干预],PDGF-BB组（rrPDGF-BB预处理24 h,无毛蕊花糖苷干预）,对照组（无rrPDGF-BB预处理,无毛蕊花糖苷干预）;分别采用划痕实验检测细胞迁移能力,ELISA法检测Ⅰ型胶原（Col-I）含量,Western blot检测纤维化HSC活化标志物α-SMA蛋白、凋亡效应分子caspase-3,及ERK1/2、Akt信号通路相关蛋白的表达水平。结果：与对照组比较,PDGF-BB组能促进HSC的迁移（P < 0.01）,毛蕊花糖苷（1.5、3.0、6.0 mg/L）组能明显抑制HSC的迁移（P < 0.01）,且毛蕊花糖苷抑制HSC的迁移有明显的剂量依赖性（r=0.894,P=0.038）;随着受试物浓度的增加,Col-I分泌呈现降低趋势,其中毛蕊花糖苷6 mg/L组抑制胶原产生的作用效果最明显（P < 0.01）;毛蕊花糖苷（1.5,3.0,6.0 mg/L）组能够抑制α-SMA蛋白的表达、激活caspase-3的活性,使ERK1/2、P-ERK1/2、Akt、P-Akt蛋白表达明显降低,且测定蛋白的表达在毛蕊花糖苷各剂量组间也呈现一定的剂量-效应关系（0.826 < r < 0.997,P < 0.01）。结论：毛蕊花糖苷可抑制rrPDGF-BB诱导的HSC的活化、迁移和纤维化作用,其机制可能与毛蕊花糖苷激活caspase-3,阻断ERK1/2、Akt信号通路,抑制HSC中细胞外基质过度沉积及胶原形成有关。     

肉苁蓉苯乙醇总苷及其单体对肝星状细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨肉苁蓉苯乙醇总苷（CPhGs）及其单体（毛蕊花糖苷和松果菊苷）对大鼠肝星状细胞（HSC-T6）增殖及凋亡的影响。方法：分别以含不同浓度（0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00和500.00 μg/mL）CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷的DMEM（高糖）完全培养液处理HSC-T6细胞48 h,用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖情况并分别获得半数抑制浓度（IC₅₀）;再分别用不同浓度受试物诱导HSC-T6细胞48 h,试验分为正常对照组,CPhGs（25、50、100 μg/mL）组,毛蕊花糖苷（1.5、3、6.0 μg/mL）组及松果菊苷（125、250、500 μg/mL）组,流式细胞仪检测细胞凋亡的比例,Western blot检测细胞中凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果：CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷对HSC-T6细胞的增殖抑制率随着浓度的增加逐渐升高,IC₅₀分别为119.1、7.0和520.3 μg/mL;与正常对照组比较,3种受试物诱导HSC-T6细胞的凋亡率差异均具有统计学意义（P < 0.01）,其中,CPhGs 100 μg/mL、毛蕊花糖苷6.0 μg/mL及松果菊苷500 μg/mL浓度组的凋亡率分别为24.40%±3.16%,34.73%±1.16%和21.13%±0.98%;除毛蕊花糖苷1.5 μg/mL组外,其余不同浓度的受试物组均可引起HSC-T6细胞中Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调（Bcl-2/Bax比值降低）（P < 0.05）。结论：CPhGs及其单体（毛蕊花糖苷和松果菊苷）可诱导HSC-T6细胞凋亡而抑制其增殖,从而起到抗肝纤维化的作用,3种受试物的抗肝纤维化效果排序为毛蕊花糖苷 > CPhGs > 松果菊苷。