纳米磁诱导肝癌Hep-6细胞凋亡实验研究

目的　研究纳米磁诱导肝癌Hep -6细胞凋亡 ,提供肝肿瘤局部靶向消融新方法。方法　应用电泳 ,扫描电镜 ,透射电镜 ,流式细胞仪检测凋亡。该实验设空白对照组、药物对照组和纳米磁处理组 ,在不同剂量与时间点条件观察纳米磁诱导肝癌Hep -6细胞凋亡率。结果　纳米磁组细胞凋亡率 2 4h时由 2 5 %上升到 5 4% ;3 6h时 ,纳米磁组、表阿霉素组、空白对照组的凋亡率分别为 78% ,5 3 % ,2 % ,各组之间凋亡率差异有显著性 (t =3 0 5 ,P <0 0 5 ) ,凋亡率、药量、与时间呈正相关 (r=0 96,P <0 0 5 )。结论　纳米磁可诱导肝癌Hep -6细胞凋亡 ,可以提供肝肿瘤有效的靶向消融治疗。     

人血管生成素的基因克隆及真核表达

血管生成素 (angiogenin ,ANG)是存在于正常血浆及实体肿瘤组织中的一种属于核糖核酸酶超家族[1] ,分子量为 14 1kD、pI9 5的蛋白质 ,基因定位于染色体 14q11。ANG是一种能有效促进新生血管形成的刺激因子 ,具有很强的促血管生成作用。因此开展ANG的相关研究在损伤修复及组织工程学中极有意义。本文旨在构建ANG真核表达载体 ,转染人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) ,研究其在HUVEC中的表达情况 ,为进一步研究ANG对HUVEC生长状况的影响以及ANG在组织工程学中的应用奠定基础。1　材料与方法1 1　材料　EcoRⅠ、BamHⅠ为Promega产品 ,…     

Stealth siRNA对HBV复制和表达的抑制

目的设计siRNA并检测其对HBV的抑制作用。方法针对HBV基因组设计siRNA基因序列,化学修饰合成3种Stealth siRNA,转染带有HBV的2．2．15细胞,ELISA法检测其对HBV复制和表达的影响。结果3种Stealth siRNA对HBV的复制和表达在不同时间有不同程度的抑制作用。72h后就可检测出抑制,其中siRNA508效果最显著。结论合成的Stealth siRNA可以抑制HBV的复制和表达,有望成为控制HBV感染的一种手段。     

自体恶性黑色素瘤抗原激活的树突状细胞体外诱导免疫试验

树突状细胞(dendritic cells,DC)是迄今为止所知的抗原呈递能力最强的抗原呈递细胞(antigen presenting cells,APC).肿瘤患者因DC免疫功能低下致宿主抗肿瘤免疫无能.研究表明,人外周血单核细胞在体外用粒/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)及白介素4(IL-4)诱导后,可培养出表达高水平MHCI、MHCII类抗原和CD80、CD86等因子的DC.本实验拟应用黑色素瘤患者外周血单核细胞,经GM-CSF及IL-4诱导后获得DC,再经自体肿瘤细胞冻融物冲击,在体外激活自体T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL),观察其体外抗肿瘤作用.     

GM-CSF膜修饰B16.F10黑素瘤细胞疫苗对小鼠种植肿瘤的抑制作用

目的: 研究粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor, GMCSF)膜修饰小鼠黑素瘤B16.F10细胞制备的疫苗对小鼠种植肿瘤的抑制作用。方法：采用生物素链亲合素GMCSF融合蛋白技术制备GMCSF膜修饰B16.F10黑素瘤细胞疫苗,将BALB/c小鼠随机分为GMCSF膜修饰B16.F10细胞疫苗组、GMCSF与B16.F10细胞混合疫苗组、B16.F10细胞疫苗组、GMCSF组、生理盐水组。各组于第1天和第7天分别进行免疫接种,第14天皮下注射0.2 ml B16.F10细胞（1×106个细胞）进行攻击,观察各组小鼠无瘤率和生存期;攻击后24 d 用ELISA法检测小鼠脾细胞INFγ分泌水平。结果：接受B16.F10细胞攻击后第60天和第90天,GMCSF膜修饰B16.F10细胞疫苗组小鼠均未成瘤,存活率为100%;GMCSF与 B16.F10细胞混合组无瘤率分别50%和40%,存活率分别为70%和40%;B16.F10细胞疫苗组无瘤率均为20%,存活率分别为80%和20%;GMCSF组和生理盐水组无瘤率为0,无小鼠存活。GMCSF膜修饰B16.F10细胞疫苗组的IFNγ分泌量比其他组明显升高（P<0.01）。结论：GMCSF膜修饰B16.F10肿瘤细胞疫苗可以激发BALB/c小鼠特异性抗肿瘤免疫反应,有效防止B16.F10肿瘤细胞的攻击。     

人血管生长素的真核表达及亚细胞定位

目的:建立人血管生成素(angiogenin,ANG)的真核表达系统并在细胞内亚定位。方法:采用亚克隆技术构建重组荧光真核细胞表达质粒pEGFP/ANG,然后经脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)并对转染细胞内pEGFP/ANG的表达用荧光显微镜和免疫组化染色进行鉴定。用共聚焦显微镜和免疫电镜观察ANG的亚细胞定位。结果:荧光显微镜观察可见转染的HUVEC内发出强绿色荧光。免疫组化染色检测显示,转染的HUVEC中有棕色颗粒。共聚焦显微镜及免疫电镜检查显示,ANG集聚于细胞核区。结论:以构建的重组体pEGFP/ANG转染HUVEC后,可表达人ANG蛋白;表达的ANG定位于细胞核区。     

经癌胚抗原重组痘苗病毒转染的树突状细胞体外诱导特异性T细胞免疫

目的研究人癌胚抗原重组痘苗病毒(rV-CEA)转染外周血树突状细胞(DC)后能否在体外诱导CEA特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫。方法将rV-CEA转染外周血单核细胞来源的DC后用于激发同源的T细胞,检测其对T细胞的增殖作用以及对CEA分泌性肿瘤细胞的杀伤活性,并与未经rV-CEA转染的DC激发的T细胞进行比较。结果经rV-CEA转染的DC激活的T细胞对CEA分泌性肿瘤细胞具特异性杀伤作用。结论rV-CEA转染的DC可以诱导CEA特异性T细胞活性。     

唑来膦酸诱导骨巨细胞瘤基质细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的　探讨唑来膦酸诱导骨巨细胞瘤基质细胞向成骨细胞分化的可行性。方法　取我院收治的７例唑来膦酸治疗前后的患者肿瘤组织切片行ＨＥ染色、茜素红染色、碱性磷酸酶（ＡＬＰ）染色以及成骨前因子Ⅰ型胶原和骨唾液蛋白（ＢＳＰ）的免疫组化染色。取１０例未予唑来膦酸治疗的患者术中切除的骨巨细胞瘤新鲜组织进行原代培养,待骨巨细胞瘤基质细胞贴壁生长后分别给予１μｍｏｌ／Ｌ唑来膦酸诱导１２天后行ＡＬＰ染色、免疫组化法检测Ⅰ型胶原和ＲＴ-ＰＣＲ检测Ｃｂｆａ-１的表达。结果　（１）唑来膦酸治疗前,肿瘤组织切片中骨巨细胞瘤基质细胞ＢＳＰ染色阴性或低至中度阳性、Ⅰ型胶原染色阴性或轻度阳性,茜素红和ＡＬＰ染色均为阴性;治疗后,茜素红染色阳性,ＡＬＰ染色弱阳性,ＢＳＰ和Ⅰ型胶原染色均转为强阳性,３例患者组织切片中ＨＥ染色发现类骨质或骨矿化的增加。（２）原代培养的骨巨细胞瘤基质细胞中予１μｍｏｌ／Ｌ唑来膦酸诱导１２天,空白对照组ＡＬＰ和Ⅰ型胶原染色均为弱阳性表达,唑来膦酸诱导组呈阳性表达。ＲＴ-ＰＣＲ检测发现唑来膦酸诱导组骨巨细胞癌基质细胞中Ｃｂｆａ-１表达,而空白对照组未见Ｃｂｆａ-１表达。结论　体内外研究初步证实,骨巨细胞瘤基质细胞具有向成骨细胞分化的潜能并在唑来膦酸的诱导下向成骨细胞分化,这从细胞和分子生物学水平部分解释了临床上长期应用唑来膦酸治疗后肿瘤病灶和术后残留囊壁中的明显骨生成的现象。     

9L/F344大鼠脑胶质瘤模型的建立

目的建立稳定的9L/F344大鼠脑胶质瘤模型.方法15只近交系雄性F344大鼠,采用立体定向技术,在大鼠右侧额叶尾状核接种1×105个9L细胞,观察大鼠生存状态;接种后第10、20天行MRI检查,观测颅内肿瘤生长情况.大鼠死亡后,取脑制作病理切片,行HE染色后观察肿瘤组织形态,采用免疫组织化学方法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S-100蛋白.结果大鼠接种肿瘤细胞后30 d内全部死亡,平均生存时间(24.4±3.3)d.接种后10 d,MRI增强扫描即可见肿瘤生成;接种后20 d,MRI检查可见接种侧脑组织大片水肿,增强扫描肿瘤显像清晰.脑内均见肿瘤形成,未见肿瘤颅外生长;肿瘤周边界线较明显,但未见包膜;瘤内新生血管丰富,可见出出血、坏死;肿瘤免疫组织化学GFAP和S-100蛋白染色阴性.结论该方法建立的大鼠脑胶质瘤模型稳定可靠,符合恶性胶质肉瘤生物学特性.该模型是理想的脑胶质瘤实验研究材料.