RNA干扰技术抑制类风湿关节炎成纤维细胞COX-2合成

目的 体外合成针对人环氧化酶-2（hCOX-2）的小分子干扰RNA（siRNA）,并转染人人滑膜成纤维细胞,通过比较不同siRNA抑制COX-2 mRNA表达、COX-2蛋白合成以及下游产物PGE2水平,旨在确定特异性阻断人滑膜成纤维细胞COX-2的siRNA.方法 分离、培养和传代人类风湿关节炎（类风关）滑膜成纤维细胞.设计合成4条针对hCOX-2 mRNA siRNA（1#-4#siRNA）,1条随机序列siRNA.设立1#-4#siRNA和随机序列siRNA组（NC）及未转染对照组（CTL组）.应用Lipofect AMINE 2000将上述siRNA分别转染人滑膜成纤维细胞,4 h后各培养孔加入终浓度为100 nmol/L的佛波酯.转染36 h、48 h后,各组提取蛋白质和总RNA,应用RT-PCR检测hCOX-2 mRNA表达水平,通过Western Blot检测hCOX-2蛋白表达水平.采用ELISA方法检测各组上清液PGE2的水平.结果 转染36 h,PCR结果显示,CTL、NC、1#siRNA、2#RNA、3#RNA、4#siRNA、阳性对照HeLa细胞组hCOX-2 mRNA电泳条带密度值分别为1、0.72、0.3、0.25、0.4、0.04、2.1.Western Blot结果提示上述各组hCOX-2蛋白密度值分别为1、1.04、0.52、0.39、0.9、0和2.48.转染48 h后,各组hCOX-2蛋白条带密度值分别为0.05、0.52、0.51、0.9和0.15.转染24 h、48 h和72 h后,4#siRNA组培养上清液PGE2的水平较其他各组低.结论 4#siRNA能有效抑制人滑膜成纤维细胞COX-2 mRNA表达和COX-2蛋白的合成,且上清液中PGE2水平最低,证实4#siRNA能特异性阻断COX-2在滑膜成纤维细胞表达.     

类胰蛋白酶对微血管内皮细胞中IL-6和TNF-α表达的影响

目的研究肥大细胞类胰蛋白酶（tryptase）对小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd-3表达白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响以及可能的信号途径。方法bEnd-3细胞与不同浓度的类胰蛋白酶共同培养后,用RT-PCR和放射免疫的方法检测细胞及其上清液中IL-6、TNF-α mRNA和蛋白的表达量以及蛋白酶激活受体2（PAR-2）对其表达的影响。结果类胰蛋白酶上调bEnd-3 IL-6和TNF-α mRNA的表达和分泌,并呈时间和剂量依赖性,这一作用可能是通过激活细胞膜上的PAR-2而发挥的。结论肥大细胞类胰蛋白酶参与bend-3微血管内皮细胞的致炎性反应。     

类胰蛋白酶对血管内皮细胞表达干细胞因子的作用及机制

目的研究类胰蛋白酶对血管内皮细胞（ECV304细胞系）表达干细胞因子的作用及其机制。方法采用RT—PCR方法检测类胰蛋白酶刺激后ECV304细胞炎症介质干细胞因子（stem cell factor，SCF）表达情况，用Western blot方法研究p38和JNK的表达及磷酸化。采用单因素方差分析干细胞因子mRNA的表达以及t检验分析p38和c—Jun N末端激酶（JNK）磷酸化。结果类胰蛋白酶能够上调ECV304细胞的干细胞因子mRNA的表达，类胰蛋白酶也可以诱导细胞内p38的磷酸化，以上作用均可被PAR2单克隆抗体抑制。结论在ECV304细胞中，类胰蛋白酶经蛋白酶激活受体2通过p38的磷酸化，最终上调表达干细胞因子。     

rhTNF和化疗药物对人卵巢癌3Ao细胞株杀伤活性的研究

目的研究重组人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ）和化疗药物对人卵巢癌３Ａｏ细胞株的杀伤活性。方法应用ＭＨ法测定ｒｈＴＮＦ和顺铂（ＤＤＰ）、更生霉素（ＫＳＭ）、环磷酰胺（ＣＴＸ）、依托泊甙（ＶＰ１６）联合疗法对３Ａｏ细胞的杀伤活性。结果ｒｈＴＮＦ对３Ａｏ的细胞毒性作用随浓度增高而增强，４种化疗药物单用时，ＤＤＰ对３Ａｏ细胞的细胞毒性最高，而且呈现明显的剂量依赖关系，ＫＳＭ与ｒｈＴＮＦ联用对３Ａｏ细胞有较强的协同细胞毒性。结论ｒｈＴＮＦ与不同的化疗药物联用对人卵巢癌３Ａｏ细胞株有不同的杀伤活性。     

胞嘧啶脱胺酶/5-氧胞嘧啶基因系统对前列腺癌细胞系生长的抑制作用

目的　探讨胞嘧啶脱胺酶 (cytosinedeaminase,CD) / 5 氟胞嘧啶基因 (5 FC)基因系统对体外前列腺癌细胞生长的作用。　方法　经基因重组并纯化的腺病毒AdCMVCD分别感染体外前列腺癌细胞DU 14 5、RM 1,观察CD/ 5 FC系统对细胞的生长抑制作用和旁观者效应。　结果　CD/5 FC系统能明显抑制体外前列腺癌细胞系DU14 5、RM 1的生长 ,经 10 0m .o .i(multiplicityofinfec tion)AdCMVCD感染并加入 15 .5mmol/L 5 FC后 4、6d ,细胞抑制率高于 97% ;同时此系统具有很强的旁观者效应 ,当受染细胞混合比例为 10 %时 ,即有 >75 %的细胞被杀死。　结论　CD/ 5 FC系统是一种有效的基因治疗方法 ,旁观者效应为此系统在实体肿瘤中的应用提供了可行性。     

人卵巢癌细胞C－erbB－2扩增及表达抑制TNF和LAK杀伤活性的实验研究

利用人卵巢癌细胞株，在确定Ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增和过表达及Ｃ－ｅｒｂＢ２正常拷贝和低表达的基础上对Ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增及表达与ＴＮＦ和ＬＡＫ杀伤活性的关系进行研究，并以非特异性杀伤物Ｈ２Ｏ２为对照。结果表明：Ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增及过表达可明显抑制ＴＮＦ和ＬＡＫ的杀伤活性（Ｐ＜０．０５），但对Ｈ２Ｏ２的杀伤活性无显著影响。提示临床上部分卵巢癌患者用ＴＮＦ和ＬＡＫ治疗的疗效低或无反应性与Ｃ－ｅｒｂＢ－２的扩增及过表达有关。     

绒毛膜癌细胞株JEG-3细胞中DLX4基因的表达

同源异型盒基因(homeobox genes，Hbx基因)是控制细胞分化和发育的一系列转录因子。DLX4基因是Hbx基因家族的成员之一，同其他Hbx基因功能类似，调节上皮和间充质细胞的相互作用，在胚胎发育中起重要的作用。近年来的研究发现，DLX4基因的表达异常与乳腺癌、结肠癌以及白血病的发生有关。本研究检测了DLX4基因在绒毛膜癌(绒癌)细胞株JEG-3细胞中的表达，以探讨其与绒癌发生的关系。     

PKB在类胰蛋白酶诱导基因表达中的作用

目的：探讨蛋白激酶B(PKB)在类胰蛋白酶（tryptase）诱导基因表达中的作用。 方法： 采用RT-PCR和Western blotting 方法，检测tryptase对ECV304细胞PKB（Akt）的表达及其活性和对转录因子AP-1、NF-κB p65亚单位、JNK、p38MAPK、趋化因子IL-8表达的影响。 结果： 在ECV304中1 μg/L tryptase可使PKB蛋白质磷酸化水平增加并促进PKB、转录因子NF-κB P65亚单位、AP-1和趋化因子IL-8的表达，但对JNK、p38MAPK表达影响不大。PI3K特异性抑制剂LY294002可抑制PKB的表达增加，同时可抑制NF-κB P65亚单位和IL-8的表达增加；反义PKB质粒瞬时转染ECV304，可抑制PKB、AP1、NF-κB P65亚单位和IL-8的表达增加；PAR2的抗体可抑制PKB的磷酸化，但不能阻断PKB表达。 结论： 在ECV304细胞tryptase经其膜受体PAR2通过PI3K促进PKB的磷酸化而激活之，通过其下游途径促进趋化因子IL-8、转录因子AP-1、NF-κB P65亚单位和PKB本身的表达增加。     

甲孕酮对人卵巢癌3AO细胞C－erb B－2表达和形态学的影响

采用流式细胞和电镜技术，检测了甲孕酮处理前后人卵巢癌３ＡＯ细胞Ｃ－ｅｒｂＢ－２表达和形态学改变情况。结果表明甲孕酮可使部分３ＡＯ细胞Ｃ－ｅｒｂＢ－２表达下降；部分３ＡＯ细胞发生形态学改变，提示甲孕酮具有低调部分人卵巢癌３ＡＯ细胞Ｃ－ｅｒｂＢ－２表达和诱导部分３ＡＯ细胞分化的作用。     

人血清类胰蛋白酶含量测定方法的建立

目的：检测正常人血清类胰蛋白酶含量，为肥大细胞相关疾病的诊断提供依据。方法：随机抽取正常人血清标本和1例过敏性休克死亡患者血清，用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测类胰蛋白酶的水平。结果：206份正常血清类胰蛋白酶含量的平均值为2.24ng/mL。过敏性休克死者血清胰蛋白酶含量为正常人的50倍。结论：本实验建立了较灵敏的检测类胰蛋白酶的ELISA法，为临床肥大细胞相关疾病的诊断提供依据。