嗜热玫瑰红球菌嗜热脂肪酶的重组表达与酶学性质研究

嗜热脂肪酶能克服常温酶生物学性质不稳定的缺陷,在工业应用中有较大的优势,因而成为最近研究的热点.通过合成嗜热玫瑰红球菌Thermomicrobium roseum DSM 5159中的预测脂肪酶基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,并对该酶进行分离纯化和酶学性质表征.重组脂肪酶的熔融温度Tm和焓变ΔH分别为97...     

微板核酸杂交检测芽孢杆菌属的方法建立

以白酒发酵过程中的优势菌枯草芽孢杆菌为模式菌株,针对具有高保守性及特异性的16SrRNA设计一组核酸探针,建立了对芽孢杆菌属进行定性和定量分析的新型的微板核酸杂交检测方法,优化了关键检测条件。结果表明,当S1酶反应温度为42℃时,芽孢杆菌属检测探针能分开目标序列仅差一个碱基的近缘属。当捕获探针和信号探针工作浓度均为5nmol/L,与分析探针杂交温度都为50℃,杂交时间分别为60min和15min时,检测信号的强弱与细菌数呈良好的线性关系,能实现定量检测,灵敏度高达1.33×102cells/mL。本方法提供了一个快速定性定量的检测技术,具有很好的应用于白酒发酵过程中芽孢杆菌属实时监测的潜力。     

酶催化制备吡咯啉-5-羧酸和哌啶-6-羧酸的工艺

吡咯啉-5-羧酸(P5C)、哌啶-6-羧酸(P6C)是一类同代谢反应和疾病诊疗密切相关的环形亚胺化合物,在机体内氨基酸代谢中发挥重要作用。本研究利用Thermomicrobium roseum肌氨酸氧化酶对-C-N-键的催化能力建立了一种酶法制备工艺并进行了条件优化。通过薄层层析(TLC)、液质联用(LC-MS)和¹H-NMR核磁共振鉴别出化合物结构,并建立了含量测定方法。单因素实验分析反应温度、pH和底物浓度对产量的影响,并通过响应面得到P5C最佳反应条件：温度为79.33℃、pH为8.54、底物浓度为112.82 mmol/L,P6C最佳反应条件：温度80.19℃、pH为8.31、底物浓度83.58 mmol/L。在此条件下反应30 min,P5C和P6C的产量分别为340.15±9.12, 450.87±8.54 mg/L。反应48 h后,转化率分别达到81.94%和99.99%。研究结果为酶法制备P5C和P6C奠定了理论基础,为吡咯啉、哌啶类化合物的合成提供了新的思路。     

啤酒酵母谷胱甘肽的高效抽提方法

建立了一种从酿酒酵母干细胞中高效抽提谷胱甘肽(GSH)的新方法,料液比为1:8,采用醋酸-盐酸调节抽提pH值为3.5,抽提温度(70±1)℃的条件下,GSH抽提量可达5.50 mg/g,比已报道的其它抽提法提高54.49%～62.24 0A.抽提液经微滤(膜孔径0.45、0.22μm)、超滤(膜截留相对分子质量5 000)处理,蛋白质总去除率为60.98%.所得超滤液经高效液相法和氨基酸分析仪分析表明,粗提物中的杂质除蛋白质、小肽外,氨基酸类杂质主要为谷氨酸,为GSH的进一步精制提供了基础数据.     

采用图割及协同训练的动态人影检测方法

随着无人飞行器的迅猛发展,根据顶视状态下的行人动态阴影生物特征进行人物验证和行为识别成为一个重要的发展方向,而从低空无人飞行器平台获取行人动态阴影生物特征成为一个更具有挑战性的研究热点。现有的阴影提取方法大多基于固定摄像头,并不适用于运动平台。联合机器学习和图切割理论,提出了一种新的针对低空无人飞行器平台的动态人影检测方法。根据像素特征和区域特征构建协同训练的两个独立视图,以SVM为分类器,采用机器学习的方法对阴影生物特征进行半自动提取,根据上述运动结果构建最小能量方程的数据项,根据图像的梯度特征构建能量方程的约束项,运用图切割理论对上述提取结果进行优化。实验结果表明,所提出的方法比单纯的协同训练方法具有更好的效果,可进一步优化低空无人飞行器平台下所获取的阴影生物特征质量。     

人源内皮抑素在大肠杆菌中的可溶性表达

为高效制备人源内皮抑素(human endostatin, hEDN),解决其在大肠杆菌中的可溶性表达。该研究在大肠杆菌BL21(DE3)中分别构建了hedn单基因、融合标签共表达和融合表达系统,将重组菌在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导下进行摇瓶发酵,通过SDS-PAGE分析及串联飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight/ionization time of flight, MALDI-TOF/TOF)鉴定hEDN的表达情况。结果表明,在构建的重组菌中只有含有谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase, GST)促溶标签的重组菌株BL21(DE3)/pGEX-6p-1-hedn能成功实现hEDN融合蛋白的可溶性表达。进一步地,通过改变诱导温度、诱导时间、诱导剂IPTG浓度及加入诱导剂IPTG时间来优化hEDN融合蛋白的表达条件,最终确定hEDN融合蛋白的最佳发酵条件为20℃,8...     

黄嘌呤氧化酶酶学性质及共价交联固定化

研究了节杆菌Arthrobacter M3黄嘌呤氧化酶酶学性质,并利用修饰的琼脂糖介质及大孔阴离子交换树脂固定化黄嘌呤氧化酶,提高酶热稳定性。研究发现,该酶为异质二聚体,相对分子量为135 000;最适反应温度为37℃,最适反应pH为7.5。固定化结果表明,以修饰的琼脂糖介质共价交联固定化的酶热稳定性均优于大孔阴离子交换树脂类,其中以谷氨酸为连接臂的琼脂糖介质(Sepharose-Glu)固定化效果最佳。在50℃下保温3 h,相比于游离酶酶活仅剩余8.0%,Sepharose-Glu介质固定化的酶仍保留48.3%的酶活,半衰期提高了1.6倍,酸碱耐受性亦优于游离酶。     

纯化大肠杆菌表达胆固醇氧化酶的两种亲和分离介质的研究

建立了从重组菌中高效亲和制备胆固醇氧化酶的方法,将一种源自Brevibacterium sp.(DQ345780)的胆固醇氧化酶基因转入Escherichia co●BL21(DE3)表达,,选择核黄素-5’磷酸(FMN)及7-氯-异咯嗪作为亲和配体,构建胆固醇氧化酶亲和制备介质。通过两种介质的一步亲和吸附,获得纯度较高的胆固醇氧化酶样本,蛋白回收率分别为9.4%与9.9%(质量百分比),活性回收率分别为85.2%与93.4%(活性百分比)。使用SDS-PAGE分析,纯化得到蛋白分子量为约50 000,纯度分别为98.0%与97.5%(纯度百分比)。通过静态吸附分析,胆固醇氧化酶相对两种亲和介质的最大理论吸附值分别为71.0与78.5 mg/g介质;解离常数分别为12.8和7.3μg/g介质。     

古生菌来源耐热肌氨酸氧化酶的异源表达及酶学性质

由于目前大部分肌氨酸氧化酶(sacrosine oxidase, SOX)热稳定性差、失活机理研究不深入,使其在医疗和食品工业等领域的实际应用中受限。该研究通过筛选与挖掘一种热稳定性优异的肌氨酸氧化酶,以达到拓宽其应用前景与应用潜力的目的。根据预测,将来源于古生菌Archaea HR32中肌氨酸氧化酶在Bacillus subtilis WB600中异源表达,并对其酶学性质进行考察。重组蛋白rSOX大小约为42 kDa,二级结构由35.0%α-螺旋、11.1%β-折叠、23.3%β-转角及31.6%无规则卷曲组成,T_m和ΔH为92.13℃和1 070 kJ/mol。以肌氨酸为底物时,最适pH为8.0,最适温度为70℃,80℃下半衰期为12 h,K_m、k_cat和k_cat/K_m分别为1.17 mmol/L、74.59 min^-1、63.78 L/(mmol·min)。常见有机溶剂对rSOX活性影响不大,金属离子则对rSOX有不同程度的促进或抑制作用。另外,rS...     

氨基化大孔硅胶共价固定 Pancreas porcine 脂肪酶的研究

本研究以大孔硅胶为材料,对其进行环氧基和氨基两步活化,然后利用碳化二亚胺（EDC）将氨基化硅胶与Pancreas porcine脂肪酶（PPL）进行共价固定化。通过优化固定化条件,在EDC与蛋白摩尔比为50：1;载体与粗酶质量比为10：1,固定化pH为6.0, 固定化时间为8 h的条件下获得最大固定化酶酶活为86.67 U/g,远远高于未修饰硅胶物理吸附固定PPL所得固定化酶酶活（33.33 U/g）。此外,本文还利用扫描电镜（SEM）和傅立叶变换光谱仪（FT-IR）对固定化前后硅胶进行了结构表征,固定化后硅胶表面出现明显的丝状蛋白,且固定化酶在1543 cm-1处出现酰胺Ⅱ带,说明PPL成功共价固定于氨基化硅胶上。通过对所得固定化酶性质进行分析,结果表明,固定化酶最适反应pH向碱偏移一个单位,最适反应温度提高了5 ℃,热稳定性明显提高。