以CpG ODN为靶点应用生物传感器技术筛选抗炎中药

目的:筛选具有拮抗CpGODN作用的抗炎中药。方法:将CpGODN包被于生物传感器的生物素化样品池上,测定78种中药水煎液与CpGODN的亲和力;选择具有较高亲和力的中药水煎液,与CpGODN(33μg·ml-1)37℃孵育30min后,再次测定与CpGODN的亲和力。结果:78种中药中,地榆、大黄、藏青果等14种中药含有结合CpGODN的活性成分;鸦胆子、赤芍、地榆等9种中药活性成分含量较高。结论:筛选得到9种活性含量较高的中药,为下一步分离提纯有效成分单体提供了实验依据。     

以Lipid A为靶点拮抗内毒素中药的筛选

目的利用生物传感器跟踪技术从抗炎中药中筛选出具有拮抗内毒素的中药,为进一步对中药拮抗内毒素活性成分的分离纯化提供实验依据。方法将革兰阴性细菌的脂质A(Lipid A)包被于生物传感器的非衍生板建立靶点,跟踪测定赤芍、大黄、黄芩等78种中药的水提物和醇提物与Lipid A的结合活性,再将筛选出的中药去鞣质后与定量的内毒素(LPS,20、50ng·ml-1)37℃孵育30min后,测定孵育后的样品与Lipid A的结合情况,以评价样品内的活性物质含量。结果在所筛选的78种中药中有12种中药的水提物与Lipid A具有较高的亲和活性,在这12种中药中有6种中药的醇提物与Lipid A也具有较高的亲和活性;通过对所筛选出的12种中药的水提物去除鞣质后与LPS的消耗实验,发现所筛选出的12种中药均含有除鞣质以外的与lipid A具有特异性结合的物质,并且12种中药中能与Lipid A发生特异性结合作用的活性物质含量存在较大的差异。结论生物传感器跟踪技术是一种快速、准确、有效的筛选平台,筛选出的12种中药均含有非鞣质类能与lipid A发生特异性结合作用的物质,为进一步对12种中药抗内毒素有效部位或单体的分离提供了重要的实验依据。     

模拟肽聚糖表位的序列分析及其抗原性鉴定

目的:在线预测肽聚糖(PGN)模拟抗表原位并鉴定其抗原性。方法:利用抗PGN单克隆抗体从12线性噬菌体随机展示肽库中筛选模拟PGN表位的阳性克隆,对阳性克隆进行DNA测序和推导氨基酸序列,结合生物信息学分析阳性序列GRWxHxVxWAGL的抗原性以及T细胞表位,根据分析对阳性序列进行修饰与合成,ELISA法鉴定阳性序列的抗原性。结果:经对噬菌体12线性肽库的3轮筛选,夹心ELISA鉴定得到16个与抗PGN单克隆抗体结合的克隆,DNA测序并推导氨基酸序列,该序列与前期具有抗金黄色葡萄球菌活性序列No.31(ATWxHxLxSAGL)含有保守序列WxHx…AGL。在线分析(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl,www.syfpeithi.de,http://www.darrenflower.info/mhcpred)表明,含保守序列的阳性序列GRWxHxVxWAGL包含与人和小鼠MHC结合表位(-WxHxVxW-),C端加入AGGS后具有T细胞表位(DNAstar),据此合成线性肽Biotin-GRWxHxVxWAGLAGGS(命名为SP39)。ELISA结果显示,SP39能与抗PGN单抗及抗S.aureus全菌多抗结合,PGN能抑制SP39与抗PGN单克隆抗体结合。结论:经噬菌体肽库筛选获得阳性序列GRWxHxVxWAGLAGGS,该序列可能模拟PGN抗原表位。     

以高亲和力结合血红蛋白β链与δ链单克隆抗体的研制

目的:制备可同时识别血红蛋白A2(HbA2)与血红蛋白A(HbA)的单克隆抗体(mAb),即与血红蛋白的δ链与β链结合,而不与γ链结合。方法:以原核表达的重组Hbδ链免疫小鼠,常规融合制备杂交瘤细胞,以离子交换层析分离的天然HbA2与HbA为抗原同时进行筛选;所获mAb用间接ELISA、基于变性与非变性聚丙烯凝胶电泳的Western blot、等离子表面共振及流式细胞术进行鉴定。结果:所获mAb2C9以高亲和力与纯化的天然HbA2与HbA结合,经等离子表面共振测定KA值分别为2.25×1011、2.16×1010;该mAb不与胎儿血红蛋白(HbF)、血红蛋白α链及重组血红蛋白ζ(zeta)链结合。结论:获得1株可结合HbA2与HbA的mAb2C9,提示其识别血红蛋白δ链与β链的共同表位。该抗体将成为研究与诊断血红蛋白病的有效工具。     

73例尿培养菌落计数不达标标本的临床分析

目的分析尿培养菌落计数不达标的原因,以提高尿细菌学检测的临床符合率。方法对73例尿培养菌落计数不达标住院患者的临床资料进行回顾性分析。结果 73例尿培养菌落计数不达标患者中82.19%(60/73)有真性尿路感染。81.67%(49/60)的患者提前使用了抗生素,但抗生素提前使用的有效率仅为48.98%(24/49)。有临床尿路感染者尿沉渣涂片镜检有WBC所占比例显著高于尿沉渣涂片镜检无WBC的病例、尿培养阴性所占比例显著高于尿培养阳性(均P<0.01)。尿培养+尿沉渣涂片镜检阳性、阴性总符合率和误诊率均显著高于尿培养(均P<0.01)。结论单纯尿定量培养不足以对提前使用抗生素患者进行尿路感染的实验室诊断,需要结合尿沉渣涂片以排除因抗生素误用或滥用导致的假阴性报告。     

晚期氧化蛋白产物模拟表位的初步研究

目的利用噬菌体展示肽库筛选技术获得模拟人晚期氧化蛋白产物（advanced oxidation protein products,AOPP）表位的序列,探索该表位的分布与表达。方法以抗晚期氧化蛋白产物多克隆抗体为靶,对噬菌体随机12肽库进行免疫亲和筛选,ELISA鉴定阳性噬菌体克隆特异性;对阳性克隆进行DNA测序并推导其氨基酸序列,利用生物信息学技术检索其分布与相似性。结果经3轮亲和筛选获得18株与靶分子特异结合的阳性噬菌体克隆,阳性率为62.07%。竞争ELISA结果表明,AOPP可有效抑制阳性噬菌体克隆与抗体结合,其中对No.6克隆的IC50达到0.2ug/ml,提示其能模拟AOPP表位。经DNA测序并推导氨基酸序列,得到LXDMLXD保守序列（X为任意氨基酸）;发现该序列不存在于正常人与哺乳动物的蛋白分子,但与某些真菌及寄生虫蛋白分子有同源性。结论通过噬菌体肽库筛选技术获得模拟AOPP表位并具良好抗原性的短肽序列;证实该结构不存在于正常人与哺乳动物蛋白分子,正如AOPP并非正常组织蛋白。     

应用生物传感器技术筛选拮抗细菌肽聚糖的中药

目的 应用生物传感器技术从传统抗炎中药中筛选具有拮抗细菌肽聚糖(peptidoglycan, PGN)活性的中药并对其进行活性物质含量的排序.方法 将可溶性PGN包被于生物传感器的生物素化样品池以建立靶点,测定114种中药水提液去鞣质后与PGN的亲和力;选择亲和力较高的26种药物与定量PGN (50ng/ml) 37℃混合孵育30min,再测定其与PGN的亲和力,以评价药物水提液中活性物质的含量.结果 114种中药中,侧柏叶、黄连、牡丹皮等26种中药与PGN具有较高亲和力(＞100RU);侧柏叶、地骨皮、毛冬青等9种中药中与PGN特异性结合的活性物质含量较高.结论 生物传感器跟踪技术快速、高效、客观,应用其筛选具有结合PGN作用的中药具有可行性,筛选出的9种中药均含有非鞣质类能与PGN发生特异性结合作用的活性物质.     

牡丹皮抗内毒素活性研究

目的对传统中药牡丹皮(Paeonia suffruticosa Andr,PSA)抗内毒素(LPS)活性组分进行定向分离及体内外活性评价。方法利用生物传感器、硅胶柱层析、聚酰胺层析、离子交换-HPLC等技术对牡丹皮进行活性组分的定向分离。通过活性组分对LPS介导RAW264.7分泌细胞因子的抑制实验、对LPS和热灭活大肠杆菌攻击小鼠的保护实验,评价所得活性组分对内毒素的拮抗作用。结果从牡丹皮水提取物中分离到一个与Lipid A具有较高结合活性的组分(PSA-3),PSA-3在体外能抑制LPS介导的RAW264.7细胞释放TNF-α(P45μg<0.05,P90、180μg<0.01),对致死剂量LPS攻击小鼠的保护率为50%(P<0.01),对致死剂量热灭活大肠杆菌攻击小鼠的保护率为50%(P<0.05),而低结合活性PSA-1组分则不具有抑制作用,对LPS和热灭活大肠杆菌(HK-E.coli)攻击小鼠也无保护效果。结论从牡丹皮中分离到一个与Lipid A具有较高结合活性的组分,该组分在体内外对LPS均具有一定的拮抗作用。     

两种方法检测替加环素对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌体外药敏结果的分析

目的比较两种方法检测替加环素对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌体外药敏结果的差异。方法分别采用纸片扩散法和MIC测试条fMTS）法检测替加环素对23株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的体外敏感性。结果MTS法敏感率为100％;而纸片扩散法敏感率为95．7％,出现4．3％的中介菌株。若以MTS法为标准,纸片扩散法检测的次要误差率为4.3％,无重要误差和严重误差。结论纸片扩散法和MTS法检测替加环素对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的体外敏感性时,其结果存在差异。关键词：碳青霉烯酶;肺炎克雷伯菌;替加环素     

TLR2配基Pam3CSK4对小鼠中性粒细胞吞噬耐甲氧西林金黄色葡萄球菌功能的影响

目的探讨Toll样受体2(TLR2)配基Pam3CSK4对小鼠骨髓来源中性粒细胞吞菌功能的影响。方法取小鼠骨髓中性粒细胞,给予Pam3CSK4或LTA刺激,采用流式细胞术检测中性粒细胞对热灭活的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌(CR-AB),耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌(CR-KP)的吞噬作用;磁珠分选中性粒细胞,给予Pam3CSK4刺激24 h、48 h后,q-PCR检测中性粒细胞IL-1β,IL-6,IL10,TNF-α,FcγRⅢ,i NOS,COX-2等基因表达水平的改变;Pam3CSK4刺激中性粒细胞不同时间后再给予热灭活的MRSA刺激,收集培养上清液,ELISA检测IL-1,IL-6,TNF-α细胞因子的表达水平。结果 Pam3CSK4刺激组的中性粒细胞对热灭活MRSA的吞噬率为41.1%,明显高于PBS对照组(18.4%),但Pam3CSK4刺激组对CR-AB和CR-KP的吞噬率与对照组相比没有明显改变。Pam3CSK4刺激中性粒细胞12 h,24 h后IL-6和TNF-α的表达与PBS对照组相比明显增加,差异有统计学意义(P0.05),此外,Pam3CSK4刺激组增强中性粒细胞IL-1β、IL-6、IL10、TNF-α、FcγRⅢ、i NOS、COX-2的m RNA的表达(P0.05)。结论 Pam3CSK4可以增强中性粒细胞对MRSA的吞噬作用。