小干扰RNA逆转三氧化二砷耐药的白血病K562/AS2细胞Topo Ⅱ基因表达的实验研究

 目的　研究小干扰RNA片段（shRNA）对三氧化二砷（ATO）耐药的白血病细胞株K562／AS2细胞的TopoⅡα、TopoⅡβ基因表达及其功能的影响。方法　设计并合成针对TopoⅡα和TopoⅡβ基因序列的shRNA各3对,在脂质体的介导下转染K562／AS2细胞;用荧光实时定量聚合酶链反应（PCR）分析TopoⅡα、TopoⅡβ mRNA的表达水平;流式细胞术检测TopoⅡα、TopoⅡβ蛋白表达。结果　针对TopoⅡα- shRNA、TopoⅡβ的shRNA作用于K562／AS2细胞24 h后,TopoⅡα mRNA水平和蛋白水平最大下调为（78.22±0.01）%、（31.17±1.27）%（P＜0.05）,TopoⅡβmRNA水平和蛋白水平最大下调为（57.36±0.01）%、（23.98±1.22）%（P＜0.05）。结论　转染24 h后针对TopoⅡ的shRNA可抑制对ATO耐药的白血病细胞株K562／AS2 细胞TopoⅡ基因的表达。     

以亚砷酸为主方案治疗急性早幼粒细胞白血病的分子生物学疗效

 目的　观察以亚砷酸为主的方案治疗初治的急性早幼粒细胞白血病（APL）的细胞学及分子生物学疗效。方法　56例APL患者均经骨髓细胞形态学检查、组织化学检查、免疫表型测定以及FISH法和实时定量PCR法检测PML／RARα融合基因而确诊。诱导化疗方案采用亚砷酸10 mg／d,静脉滴注,直至获得完全缓解。缓解后采用亚砷酸与化疗交替治疗,以亚砷酸为主。对20例患者的PML／RARα融合基因进行动态观察。结果　56例PML-RARα融合基因阳性的初治APL患者完全缓解率98.2 ％,CR中位时间32（23～42） d。实时定量RT-PCR检测阳性的32例患者中位随访期3年,总生存率100 ％,复发率3.12 ％。完全缓解24个月后分子生物学缓解率100 ％（6／6）。结论　以亚砷酸为主的方案治疗PML／RARα融合基因阳性的APL患者疗效好,血液学缓解后24个月有可能获得分子生物学缓解。     

尼洛替尼治疗伊马替尼耐药的慢性髓系白血病临床分析

目的:探讨尼洛替尼治疗伊马替尼耐药的慢性髓系白血病(CML)的疗效及安全性。方法:收集伊马替尼治疗失败而接受尼洛替尼治疗的10例患者,其中慢性期7例,加速期2例,急变期1例。接受伊马替尼治疗的平均时间为36.7个月,停用原因为丧失疗效或未达主要分子学反应(MMR)7例、进展至加速期或急变期2例、原发性耐药1例。4例患者检测出5个点突变,其中1例慢性期患者检出2个突变点。10例患者接受尼洛替尼的剂量均为400mg q12h,每个月复查血常规,每3个月监测细胞遗传学及分子生物学缓解情况(FISH及RQ-PCR法),定期监测肝肾功能、胰酶、电解质及心电图等,并记录有无皮疹、头痛等不良反应。结果:10例患者接受尼洛替尼治疗的平均时间为12.5(3～30)个月。8例获得主要遗传学反应以上疗效,其中5例获得完全细胞遗传学反应,3例获得MMR。2例加速期患者中,1例恢复至慢性期并持续获得MMR,1例死亡。1例急单变患者(Ph+伴附加染色体异常)获部分细胞遗传学反应后丧失疗效,最终死亡。不良反应依次为轻度皮疹6例、胆红素升高3例、转氨酶升高2例、头痛1例、血糖升高1例及3/4级血液学不良反应1例。结论:尼洛替尼结合ABL激酶的效价更高,选择性更强,能抑制除T315I、Y253H、F359V/C及E255K/V以外的致伊马替尼耐药的点突变,且不良反应少,可用于伊马替尼耐药及不耐受的慢性期或加速期CML。     

超速离心法与聚乙二醇沉淀法提取人多发性骨髓瘤细胞来源外泌体的比较

目的:鉴定比较超速离心法和聚乙二醇(PEG)沉淀法提取人多发性骨髓瘤细胞来源外泌体。方法:人多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226经去除外泌体无血清培养24~48 h培养后,分别使用超速离心法和PEG沉淀法进行外泌体的提取,分别测定两种方法所得外泌体的蛋白含量,并进行电镜鉴定比较。结果:超速离心法所提取外泌体测得实际浓度为(1.095±0.031)μg·μL~(-1),沉淀法所提取外泌体实际浓度为(2.069±0.086)μg·μL~(-1),组间比较,差异具有统计学意义(P0.001);超速离心法测得外泌体蛋白总量(109.513±3.113)μg,沉淀法所提取外泌体测得蛋白总量(206.883±8.580)μg,组间比较,差异具有统计学意义(P0.001)。电镜下超速离心法分离外泌体清晰可见,沉淀法提取的外泌体含有较多杂质,影响电镜观察。结论:超速离心法方法简单,耗时少,外泌体纯度高,可用于外泌体的蛋白、DNA和免疫功能研究。沉淀法耗时较长,所得外泌体杂质蛋白含量多,不适用于外泌体蛋白分析,可用于RNA分析。     

TFPI-2对K562细胞体外生长和侵袭能力的影响

目的研究组织因子途径抑制物-2（TFPI-2）基因对白血病细胞系K562细胞生长和侵袭的影响。方法通过脂质体法将TFPI-2基因转染到K562细胞,用实时定量RT—PCR和Western blot分别检测转染前后TFPI-2mRNA和其蛋白质的表达。生长曲线测定,平板克隆和（Transwell）小室穿透实验测定转染前后3组细胞生长、恶性增生能力以及体外侵袭能力的差异。结果转染成功TFPI-2基因的K562细胞（K562-T）有TFPI-2mRNA及其蛋白质的表达,与对照组K562组、K562-V组细胞相比,K562-T细胞生长速度缓慢,克隆形成率明显低于前2组（P〈0．05）,有统计学意义;其穿膜细胞数（16±4．51）明显低于前两者（33．67±4．51）及（28．67±3．51）,P〈0．05,有统计学意义。结论TFPI-2基因对K562细胞的生长和侵袭能力有抑制作用。     

多发性骨髓瘤微小RNA基因序列突变的检测及其意义

目的 了解多发性骨髓瘤(MM)患者微小RNA(miRNA)基因突变率及其临床意义.方法 采用聚介酶链反应单链构象多态性(PCR-SSCP)银染法检测4种人类MM细胞系(KM-3、ARH-77、U266、RPMI8226)、20例MM患者及20例血液学正常者12种miRNA基因突变,实验结果结合临床分析.结果 细胞系KM-3、RPMI8226检测出miRNA-335基因突变;MM患者中检出miR-19a、miR-19b和miRNA-335基因突变各1例,总突变率为15.00%(3/20);正常对照组未检出突变.病例组突变者中1例确诊4个月左右死亡,2例取材时已处于疾病终末期.结论 miRNA基因在MM中存在较高的突变率,miR-19a、miR-19b和miRNA-335基因突变可能与MM发病机制有关;发生突变的患者(表现)临床预后差,对miR-19a、miR-19b和miRNA-335基因突变的检测可能有助于对MM病程进展和预后的分析.     

多发性骨髓瘤微小RNA基因序列突变的检测及其意义

 目的　了解多发性骨髓瘤（MM）患者微小RNA（miRNA）基因突变率及其临床意义。方法　采用聚合酶链反应单链构象多态性（PCR-SSCP）银染法检测4种人类MM细胞系（KM-3、ARH-77、U266、RPMI8226）、20例MM患者及20例血液学正常者12种miRNA基因突变,实验结果结合临床分析。结果　细胞系KM-3、RPMI8226检测出miRNA-335基因突变;MM患者中检出miR-19a、miR-19b和miRNA-335基因突变各1例,总突变率为15.00 %（3／20）;正常对照组未检出突变。病例组突变者中1例确诊4个月左右死亡,2 例取材时已处于疾病终末期。结论　miRNA基因在MM中存在较高的突变率,miR-19a、miR-19b和miRNA-335基因突变可能与MM发病机制有关;发生突变的患者（表现）临床预后差,对miR-19a、miR-19b和miRNA-335基因突变的检测可能有助于对MM病程进展和预后的分析。     

初治APL患者PMURARα融合基因表达

目的检测初治急性早幼粒细胞白血病（APL）患者PML／RARα融合基因异构体类型及表达水平,建立检测微小残留病的标准拷贝数基线。方法应用实时定量RT-PCR方法,采用Taqman探针技术测定32例APL初治患者骨髓标本的PML／RARα融合基因mRNA3种异构体表达水平,并比较异构体之间临床特征有无差异。结果32例PML/RARα融合基因阳性的APL初治患者中21例为PMI／RARa融合基因长型异构体,11例为融合基因短型异构体,初治患者融合基因表达量中住数为1．44％（1．29％±1．46％）。长型及短型异构体标准拷贝数（normalized copy number,NCN）中位数分别为1．40％（1．46％±1．18％）和1．28％（1．39％＋1．51％）,无明显统计学差异,P〈0．05,融合基因长型异构体患者在发病时外周血白细胞总数为6．08±13．21（×10^9／1）明显低短型患者15．11±20．26（×10^9／l）,P〈0．01。结论建立了检测APL微小残留病的高敏感性、高特异性的实时定量RT—PCR方法,对分析治疗过程的病情变化和指导治疗方案具有重要意见。     

急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因异构体cDNA实时定量PCR标准品及标准曲线的构建

目的克隆急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA作为实时定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测PML-RARα融合基因的标准品,从而构建FQ-PCR检测标准曲线。方法应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从急性早幼粒白血病患者骨髓单个核细胞的总RNA中逆转录扩增的PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA,将纯化的PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA与pMD18-T载体进行连接,转化宿主菌E.coli DH5a感受态细胞,氨苄青霉素培养基筛选阳性克隆,提取重组质粒cDNA用限制性核酸内切酶HindⅢ、EcoRⅠ进行双酶切鉴定并测序分析,最后进行实时荧光定量PCR检测。通过检测重组质粒260 nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR标准品。结果酶切鉴定、PCR扩增及测序分析均证实PML-RARα融合基因重组到pMD18-T载体。结论成功克隆急性早幼粒白血病PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA。