乳酸和乙酸对重组霍乱毒素B亚单位工程菌表达的影响

霍乱毒素Ｂ亚单位(ＣＴＢ)是口服霍乱疫苗的重要抗原之一。工程菌ＭＭ2是一株表达ＣＴＢ的大肠杆菌,产物ＣＴＢ能分泌到培养液中[1]。重组质粒ｐＭＭＣＴＢ来源于ｐＵＣ19,ｃｔｘＢ基因位于ｌａｃ启动子的下游。ｌａｃ启动子是一个化学诱导型启动子,无诱导物ＩＰＴＧ(异丙基βＤ硫代半乳糖苷)存在时,其下游基因则不能表达。但是我们的研究结果[2,3]表明,在不用ＩＰＴＧ诱导的情况下ＣＴＢ仍可得到表达,而加入ＩＰＴＧ对ＣＴＢ的表达几乎没有影响。此外,在培养基中加入乳酸或乙酸还可促进ＣＴＢ表达,这一点与多数工程菌的表达特点不同。为此,…     

尿酸氧化酶的表达纯化及活性形式鉴定

目的:在大肠杆菌内表达具有活性的黄曲霉尿酸氧化酶。方法:用重叠PCR从黄曲霉(Aspergillusflavus)3.1398中钓取了尿酸氧化酶(urateoxidase,UO,EC1.7.3.3)基因,克隆到原核表达载体pET22b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选到高表达的重组转化子菌株。经乳糖诱导目的蛋白表达,阴离子交换柱纯化,获得纯品。SDS PAGE分析样品纯度。用尿酸缓冲液测定酶活性,用戊二醛交联结合质谱法测定相对分子质量。结果:目的蛋白为胞内可溶性表达,表达量达菌体总蛋白的35%,纯化后的样品纯度达99%,其酶比活力可达35U/mg。经质谱测定重组UO单体的相对分子质量为34×103。交联后相对分子质量为160×103。结论:黄曲霉尿酸氧化酶可在大肠杆菌中可溶表达,并具有活性,其活性形式为四聚体。     

抗HBsAg单链抗体靶向干扰素的构建及原核表达

目的 构建抗ＨＢｓＡｇ人源单链抗体与人干扰素α的融合分子－抗ＨＢｓＡｇ单链抗体靶向干扰素，并在大肠杆菌中表达出活性融合蛋白。方法 利用限制性内切酶分别从含有抗ＨＢｓＡｇ人源单链抗体与人干扰素α的质粒中切出目的基因，连接到ｐＥＴ２２ｂ质粒中，构建成单链抗体靶向干扰素表达载体。利用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳、竞争性抑制实验与抗病毒实验对表达产物进行分析鉴定。结果 构建出含有抗体靶向干扰素融合基因的表达质粒，诱导１２ｈ后，在ＳＤＳ—ＰＡＧＥ上可以观察到相对分子质量约４５×１０４的目的蛋白，竞争性抑制实验与抗病毒实验表明表达的融合蛋白保留了单链抗体的ＨＢｓＡｇ特异结合活性与干扰素的抗病毒活性。结论 抗ＨＢｓＡｇ单链靶抗体靶向干扰素融合分子的构建及在大肠杆菌中的表达是成功的。     

多肽类药物制剂研究现状

多肽类药物制剂研究面临的主要问题是多肽的稳定性不好、体内半衰期短和生物膜透过性差。本文综述了多肽类药物不稳定的原因；提高多肽稳定性的方法；多肽类药物制剂货架时间的确定；多肽类药物的分析手段；多肽类药物的控释研究；多肽的非注射途径给药研究。最后还提出了多肽类药物制剂研究的展望。     

骨保护素的研究进展

骨保护素(osteoprotegerin，OPG)是1997年发现的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体家族的新成员，也称破骨细胞抑制因子(osteoclast inhibitory factor，OCIF)或称为树枝状细胞受体1(dendritic cell derived receptor-1，FDCR-1)，它是骨代谢一个重要的负调控因子。OPG是核因子KB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)、     

羧肽酶A/B亚家族

羧肽酶A/B是一类水解蛋白质或多肽C 端氨基酸残基的外肽酶。众多学者对其特性、结构及功能进行了深入的研究,最近的研究显示羧肽酶A/B具有一些新的功能。此文拟对羧肽酶A/B亚家族成员的特性、结构特征、结构与功能及其与疾病的关系作一简要综述     

大鼠羧肽酶原B在毕赤酵母中的表达与培养条件优化

目的:利用毕赤酵母表达系统,表达大鼠羧肽酶原B(procarboxypeptidaseB,proCPB)蛋白,同时探讨最优表达条件,为规模化发酵生产羧肽酶B奠定基础。方法:以RTPCR法从SD大鼠胰腺细胞中克隆了proCPB基因,将其插入pPIC9载体,转入毕赤酵母Gs115细胞,在甲醇的诱导下表达目的蛋白。结果与结论:首次实现了proCPB在毕赤酵母中的成功表达;通过表达条件的优化,使用BMGY(pH6.0)培养基,添加0.5%(体积比体积)的酪蛋白水解物和3mmol/L的PMSF,于28℃,每隔12h补加0.5%(体积比体积)的甲醇,重组酵母Gs115proCPB表达的重组蛋白可达500mg/L,表达的目的蛋白占总蛋白的94%,活化后的重组CPB相对分子质量为35.1×103,与理论值(35.2×103)极相近。活性测定表明,重组proCPB活化后的CPB的比活力可达110U/mg(CPB参照品为180U/mg)。     

培养基和溶氧对重组霍乱毒素B亚单位产量的影响

研究了培养基和溶氧对ＭＭ２工程菌产霍乱毒素Ｂ亚单位的影响。用正交试验获得了高产且廉价的ＹＣＰ培养基，０．０２５－０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐是霍乱素Ｂ亚单位高产所必需的。提高溶氧以提高产率和缩短培养时间，在５Ｌ发酵罐中培养平均产量达９３．３ｍｇ／Ｌ。分析并讨论了ＭＭ２工程菌的培养动力学过程。