组织工程化表皮膜片构建及其在供皮区的应用研究

目的构建组织工程化表皮细胞膜片并应用于供皮区创面治疗。方法利用患者少量自体或同种异体正常皮肤分离、培养、扩增的表皮细胞,接种于壳聚糖明胶膜构建成表皮细胞膜片;将膜片移植于治疗组供皮区创面、适度加压,同时设立对照组:空白材料对照以及传统油纱布对照覆盖创面。于术后5～10d、30d、90d行大体观察、组织学检查、广谱角蛋白、外皮蛋白、层粘连蛋白、免疫组织化学检测以及Ⅰ、Ⅲ型胶原比值测定(偏光显微镜、RTPCR)。结果利用自体及异体表皮细胞和壳聚糖明胶膜能够构建出人表皮细胞膜片,应用于临床供皮区创面治疗15例,经过3个月随访,疗效肯定。移植膜片创面愈合时间(8.1±1.3)d,空白材料对照区为(16.2±3.8)d,空白油纱布对照区为(23.0±5.8)d。移植膜片存活良好,结构较完整、术后30d及90d观察:12例无明显增生,3例有轻度增生(20.0%),而空白油纱布对照区11例遗留增生性瘢痕(74.4%,χ2=8.127,P<0.01)。结论表皮细胞-壳聚糖明胶膜片能促进供皮区创面早期愈合并减少后期瘢痕增生,具有良好治疗效果。     

接种浓度对人骨髓基质干细胞在脱钙骨上生长和分布的影响

目的研究不同接种浓度对人骨髓基质干细胞在脱钙骨支架上生长过程及分布的影响.方法荧光活性染料DiI标记人骨髓基质干细胞,接种于部分脱钙骨支架材料上,测定细胞的粘附率;将细胞悬液浓度分别调整为20×106、10×106、5×106/mL和空白组,依次接种于同一块脱钙骨支架4个相邻象限的中心位置上.接种后第2、7 d在倒置荧光显微镜下观察材料表面的细胞分布、生长的情况,测量细胞材料面积比.结果 DiI标记的骨髓基质干细胞的粘附率为(99.9±0.2)%,未标记的骨髓基质干细胞粘附率为(99.1±1)%,两者无统计学差异(P＞0.05).不同浓度细胞的细胞材料面积比无差异(P＞0.05).结论通过DiI标记可以动态观察细胞在材料上的生长状况.20×106、10×106、5×106/mL接种浓度均能达到覆盖脱钙骨表面直接接种部位的目的.     

脱细胞异体神经材料复合雪旺细胞的体外三维构建的活性研究

目的探讨雪旺细胞在AECM支架材料上体外三维培养的生长活性.方法将培养的雪旺细胞悬液接种在支架材料上,用MTT法、倒置相差显微镜、流式细胞仪、扫描电镜、RT-PCR、测定雪旺细胞的活性.结果 AECM上的雪旺细胞各项指标与正常培养的雪旺细胞活性比较,差异无显著意义(P>0.05),实验组雪旺细胞DNA无损伤,且能合成分泌GDNF.结论 AECM适于构建具有雪旺细胞活性的组织工程化人工神经.     

脂肪干细胞免疫学性状的初步实验观察

目的初步研究脂肪干细胞(Adiposederivedstemcells,ADSC)表面免疫分子的表达以及体外免疫调节功能,以期为组织工程提供同种异体种子细胞来源。方法体外培养人脂肪抽吸术中获取的脂肪干细胞,体外培养至第二代,流式细胞仪检测免疫分子HLA、HLA、B7-1、B7-2、CD40的表达。1×105个/孔ADSC细胞分别刺激单一异体淋巴细胞或混合双向淋巴细胞反应,观察淋巴细胞增殖情况。同时观察ADSC经IFN-γ作用后,免疫分子表达与淋巴细胞增殖的调节情况。结果ADSC表达HLA类分子,但未检测到HLA类分子阳性表达。B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD28、CD40未见明显阳性表达。人IFN-γ刺激48h后,HLA类分子表达明显增高,HLAI表达未见明显增高。异体或经IFN-γ作用的ADSC均未能刺激异体淋巴细胞增殖。同样数量的ADSC可明显抑制双相混合淋巴细胞增殖,经IFN-γ作用后抑制作用未见明显减弱。结论ADSC具有一定的体外调节淋巴细胞反应的能力,有可能成为组织工程同种异体细胞来源。     

自体骨髓基质干细胞复合珊瑚修复犬下颌骨节段缺损的初步研究

目的应用自体骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)复合珊瑚构建组织工程化骨,修复犬下颌骨节段性缺损。方法体外扩增培养、成骨诱导犬BMSCs。将第二代细胞复合珊瑚后修复犬自体右侧3cm的下颌骨节段缺损(n=6);以单纯珊瑚植入缺损处为对照(n=6),术后12、32周分别通过影像学,大体形态观察,组织学和生物力学的方法检测骨缺损的修复效果。结果成骨诱导的BMSCs在珊瑚支架上生长良好。X线片显示12周时实验组骨痂较多,对照组材料明显吸收;32周时CT、X线片和大体观察显示术后实验组骨愈合良好,对照组为骨不连;骨密度检测示实验组显著高于对照组(P<0.05);组织学示实验组有较多成熟骨呈骨性愈合,对照组为纤维性愈合;生物力学测试实验组与正常下颌骨力学强度差异无统计学意义(P>0.05)。结论自体成骨诱导BMSCs复合珊瑚形成的组织工程化骨可修复犬下颌骨节段缺损。     

软骨组织工程种子细胞的基础和应用研究进展

软骨种子细胞的老化和缺乏是限制软骨组织工程在临床应用的瓶颈问题。本文概述了目前对软骨种子细胞研究的两个方面 :扩大种子细胞的来源及预防和延缓种子细胞功能老化 ,并展望软骨组织工程在监床的应用前景。     

成纤维细胞生物学特性与扩张皮肤回缩的实验研究

目的 通过对皮肤肌成纤维细胞（ＭＦＢ）特征性α平滑肌肌动（αＳＭＡ）的检测,研究扩张皮肤回缩的机理。方法 通过犬皮肤扩张实验,采用电镜观察和免疫组化等方法检测。结果 免疫组化研究发现,扩张后皮肤真皮组织内αＳＭＡ阳性成纤维细胞仅个别散在,但超微结构显示成纤维细胞内微丝粗大明显,出现密纤、密斑。结论扩张刺激未使纤维细胞转变为肌成纤维细胞,但成纤维细胞功能活跃。具备了收缩功能的细胞结构,在细胞水平产生     

携带人TGF-β1腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础.方法 应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene 6介导腺病毒DNA转染293细胞.结果 重组hTGF-β1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoⅠ酶切后,得到14.5、8.1、4.2、4.0、2.5、1.4、0.6 kb片段.与空白腺病毒相比,5.6 kb的片段已被置换成4.2 kb和4.0 kb片段;经PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后,得到32.6 kb和2.6 kb含目的基因片段,片段大小无误,表明重组Adeno-hTGF-β1腺病毒表达系统构建成功.以重组Adeno-hTGF-β1DNA为模板的PCR产物中出现1.35 kb hTGF-β1目的基因片段,表明hTGF-β1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中.重组hTGF-β1腺病毒表达载体通过Fugene 6 介导转染293 包装细胞出现细胞病变效应(CPE).采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒,证实扩增出247 bp的hTGF-β1目的基因片断和312 bp的腺病毒骨架基因片断.结论 携带人hTGF-β1的腺病毒载体的构建成功,并能在293细胞包装,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础.     

间充质干细胞免疫负调节机制研究进展

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中含量极微的一群细胞,它们通过与造血干细胞的密切接触,支持造血干细胞的分化和成熟,另外它也可以向骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞进行多向分化。近年来研究发现,骨髓间充质干细胞具有弱免疫原性以及能够抑制T、B、NK细胞和DC的功能等一系列独特的免疫学特点,有望在将来利用骨髓间充质干细胞进行免疫介导疾病的治疗,但是目前有关免疫机制仍然有待全面深入研究。     

软骨细胞的老化对软骨蛋白聚糖代谢的影响

目的:探讨体外培养猪耳软骨细胞在老化过程中,软骨蛋白聚糖(aggrecan)的代谢状况与分子结构的变化及其水解酶(aggrecanase)表达水平的改变。由此进一步阐明aggrecan在组织工程软骨构建中起决定性的作用。方法:取体外培养P1-P8各代猪耳软骨细胞及其培养液,爱茜蓝(Alcian Blue)法检测培养液中蛋白聚糖的含量和糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)的分子结构。RT-PCR检测aggre-canase-1和-2的mRNA表达水平。结果:在P1细胞的培养液中,蛋白聚糖的含量和长链/高度硫酸化的GAG含量都是最高的。由P4细胞开始,这2项指标均显著减少(P<0.01),且两者的变化趋势有显著的相关性(P<0.01)。Aggrecanase-1 mRNA在前3代细胞基本无表达,P4细胞中有显著上升(P<0.01),随后逐渐减少,P8细胞又不再表达。Aggrecanase-2 mRNA的表达呈随机状态,与细胞代数无显著性相关(P>0.05)。结论:体外培养软骨细胞的老化对aggrecan的代谢有非常大的影响。一方面aggrecan的合成减少、大分子聚合物形成受阻;另一方面胞外基质的水解作用加剧,最终导致老化细胞的基质崩解。