电穿孔技术辅助眼内基因治疗

电穿孔法可将外源基因有效导入靶组织或器官,简单经济,可应用于多种组织器官上,近年来已成为一种新颖的非病毒基因转染体系,应用于眼内疾病基因治疗的研究屡见报道.本文对电穿孔技术辅助基因转染在眼内疾病治疗中的研究进展做一综述.     

在体电穿孔辅助基因转染视网膜色素上皮细胞层和光感受器细胞层的实验研究

目的　探讨在体电穿孔辅助基因转染视网膜色素上皮（RPE）细胞层和光感受器（PR）细胞层的可行性。方法　147只健康雄性Spragne-Dawley(SD)大鼠根据电穿孔刺激模式电压值分为5、10、15、20、25、30、35 V组,右眼视网膜下腔注射增强型绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达质粒pEGFP N1为实验眼,左眼注射TE Buffer 为对照眼。各组根据不同转染方向再分为RPE和PR两个亚组。各组除电压不同外,其余参数均为脉宽99 ms,脉冲间期0.5 s,连续5个脉冲。将带有负电荷的质粒在电场作用下,拟转染到RPE细胞层,反向置电极,拟转染到PR细胞层。转染后7 d 取各组视网膜铺片,荧光显微镜下观察EGFP表达强弱、范围及荧光细胞计数分析;采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）、实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）半定量观察EGFP蛋白和mRNA的表达。结果　转染后7 d,荧光显微镜观察发现,各组RPE亚组对照眼RPE细胞层内均未见特异性荧光表达,实验眼可见绿色荧光表达;各组RPE亚组对照眼视网膜铺片均未见荧光表达,实验眼视网膜铺片均可见转染了EGFP的RPE细胞。Western blot检测显示,随电压增加,EGFP蛋白与β-肌动蛋白条带灰度相对比值呈上升趋势。RT-PCR检测显示,各组均产生阳性扩增条带,随电压增高,EGFP mRNA与GADPH mRNA扩增条带灰度相对比值逐渐增高。结论　在体电穿孔方法可以有效辅助基因转染大鼠RPE细胞层。      

关注视神经损伤性疾病促进视神经再生研究

青光眼、视神经炎或眼外伤可累及视神经,导致视力的不可逆性损害甚至失明,视神经的有效再生对于挽救患者的视力、提高患者的生活质量、减轻患者的家庭负担和社会负担无疑具有重要意义.近年来围绕视神经再生的问题,通过调节细胞信号通路和应用神经胶质细胞、神经干细胞、神经营养因子等方法取得了一定的进展,这些进展为视神经损伤性疾病的治疗研究提供了一定的理论基础,眼科医师应积极关注和参与相关研究,共同促进视觉再生医学的进步.基于视神经再生影响因素的探讨,总结视神经再生研究的最新进展,提出研究中尚待解决的和值得进一步研究的问题.     

全盲者视觉皮层重塑的研究进展

视觉是人类最重要的感知觉之一。对于视觉功能完全损害的全盲者而言,当视觉信息被剥夺后,其视觉皮质将对其他感知觉系统(听觉、触觉等)的信息产生反应。本文就全盲者视觉皮质重塑的研究进展加以综述。     

脑源性神经营养因子-绿色荧光蛋白融合基因载体的构建、鉴定及初步应用研究

目的 构建脑源性神经营养因子(BDNF)绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒,观察其融合蛋白的特性.方法 将BDNF cDNA片段插入pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO真核表达质粒,使其与GFP同处一个阅读框架中,测序鉴定后,转染培养的雪旺细胞,用免疫组织化学和蛋白质印迹(Western botting)观察外源性目的 蛋白的表达情况,并用该质粒活体转染视神经切断的大鼠模型,观察所表达外源性蛋白的神经保护作用.结果 测序证实质粒构建成功.Western botting结果 显示.BDNF-GFP融合蛋白表达一相对分子质量为41×103大小条带.荧光显微镜下可见BDNF-GFP转染的细胞发出绿色荧光,免疫组织化学染色后,可见绿色荧光与红色荧光完全重合.转染BDNF-GFP质粒和GFP质粒的大鼠视神经切断术后7d存活视网膜神经节细胞(RGC)分别为(1201±286)、(482±151)个/mm2,存活百分比分别为(51.39±12.24)%和(20.62±6.46)%;28 d时存活的RGC分别为(715±71)、(112±24)个/mm2,存活百分比分别为(30.59±3.04)%和(4.79±1.03)%.两组存活百分比比较,差异有统计学意义(t=3.144,11.378;P<0.01).结论 BDNF-GFP融合表达载体可以转录翻译为一融合蛋白,该蛋白可自发绿色荧光,并具有BDNF的生物学活性.     

川芎嗪促进大鼠视网膜神经节细胞轴突再生的实验研究

目的通过在视网膜组织三维立体培养系统中加入不同浓度的川芎嗪溶液,观察川芎嗪对视网膜神经节细胞轴突再生的作用。方法建立体外培养的大鼠视网膜组织三维立体培养系统,将1～3d新生远交群SD（Sprague Dawley）大鼠视网膜切成0．5mm×0．5mm大小的视网膜组织,加入不同浓度（0．125、0．25、0．5、1．0g／L）川芎嗪溶液后,在相差显微镜下动态观察视网膜神经节细胞轴突的生长情况,于加药后第3、6和9天记录再生轴突的数目及长度。结果与对照组相比,各浓度川芎嗪对视网膜神经节细胞轴突生长均有促进作用,以0．5g／L浓度效果最明显,差异有统计学意义（P〈0．05）。免疫组织化学染色显示视网膜神经节细胞的轴突具有明显再生现象。结论一定剂量范围的川芎嗪可促进视网膜神经节细胞轴突再生和伸长。（中国跟耳鼻喉科杂志,2009,9：86—88）