阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶eDNA克隆和序列分析

目的 近年研究表明Rab11鸟苷三磷酸酶在调节各种真核细胞的膜转运通道中发挥着重要作用。但是，对于原生动物毛滴虫膜转运系统的研究仍甚少。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rabll鸟苷三磷酸酶基因，以便进一步探讨其功能。方法 使用SMART cDNA文库构建试剂盒构建阴道毛滴虫cDNA表达文库，用生物信息学进行TvRab11同源分析，鉴定TvRab11基因，用PCR方法扩增基因组DNA，TA克隆TvRab11 cDNA、测序及序列分析。结果 在分离出的cDNA克隆中发现一个Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因。该cDNA序列长710bp，读码框含636bp，推测蛋白质序列具211个氨基酸。序列分析表明该基因系Rab11亚家族的同源基因，其推测肽链与拟南芥Rab11c的同源性晟高（一致性60％，相似性79％），与人类Rab11b次之（一致性58％，相似性78％）。该氨基酸序列拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域和特异性Rab结构域（RabF1-5）。进化树分析也表明该基因系Rab11的同源基因。序列分析还显示该基因的基因组DNA序列与cDNA序列完全一致．提示该基因无内含子。结论分析表明该基因是阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因，其功能有待进一步研究。     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain—like基因的克隆及表达

目的克隆弓形虫RH株Calpain-like基因片段,构建原核表达载体,诱导表达Calpain-like基因重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA,在设计合成的引物中引入SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫RH株Calpain-like基因片段,插入pGEM-T载体,提取重组质粒,双酶切获得目的基因,亚克隆到原核表达质粒pET32a,重组子经双酶切、PCR和DNA序列分析鉴定,转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株速殖子cDNA中扩增出316bp的Calpain-like基因片段;含pET32a/Calpain-like的重组质粒在宿主菌经诱导后,获得与预期分子量相符的表达产物。结论成功地克隆和表达弓形虫RH株Calpain-like基因,弓形虫Calpain-like基因的克隆表达为进一步筛选弓形虫疫苗候选分子和治疗药物的靶位提供了研究基础。     

重组柞蚕抗菌肽AD的纯化及鉴定

目的从重组柞蚕抗菌肽AD毕赤酵母发酵液中分离纯化出抗菌肽纯品,并对其进行纯度、分子量和抗菌作用的鉴定。方法用离子交换和疏水层析法对发酵液中的重组柞蚕抗菌肽AD进行分离纯化,用高效液相色谱法分析产物的纯度,再用基质辅助激光解析—飞行时间质谱仪对产物进行分子量鉴定,并结合传统微量肉汤稀释法和流式细胞术分析重组柞蚕抗菌肽AD纯品对E.coli敏感株及耐药株的抗菌作用。结果重组柞蚕抗菌肽AD经离子交换和疏水层析纯化后的纯度达到98.40%,分子量为4068.15Da,与所设计的重组柞蚕抗菌肽AD大小相近。所纯化出的重组柞蚕抗菌肽AD对E.coli的敏感株ATCC25922和产β-内酰胺酶耐药株株ATCC35218的抗菌作用均为MIC 8μg/m L,而头孢他啶和氨苄西林对耐药株ATCC35218的MIC的值分别为8μg/m L和>32μg/m L。结论成功纯化分离出具有自主知识产权的重组柞蚕抗菌肽AD,其对E.coli敏感株和耐药株具有相同的抗菌效果。     

疟疾疫情预测GM(1,1)灰色模型的建立与应用效果分析

目的目的建立疟疾疫情预测模型GM（1,1）,探讨其应用于深圳市龙岗区疟疾发病率预测的可行性。方法根据1998～2004年龙岗区疟疾发病率数据建立疟疾发病率预测灰色模型GM（1,1）,并作拟合效果检验;外推预测2005年深圳市龙岗区疟疾发病率,将预测值与实际发病率比较,评价龙岗区2005年疟疾防治效果。结果疟疾发病率预测数学模型为^∧Y（t）=-12.8390e^-0.5398（t-1）＋19.9444,经拟合检验,模型拟合精度好（C=0.1559,P=1.000）。利用本模型对2005年深圳市龙岗区疟疾发病率进行外推,估计2005年龙岗区疟疾发病率为0.1224/10万,实际发病率为0.1799/10万,实际值比预测值高31.96%。结论GM（1,1）模型较好地拟合了龙岗区疟疾发病的趋势,预测结果具有一定的参考价值。龙岗区疟疾实际发病率高于预测值,提示疟疾防治工作需要巩固和加强。     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain—like基因的克隆及表达

目的克隆弓形虫RH株Calpain—like基因片段，构建原核表达载体，诱导表达Calpain-like基因重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入SalI和EcoRI酶切位点。应用FIT—PCR扩增弓形虫RH株Calpain—like基因片段，插入pGEM—T载体，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，亚克隆到原核表达质粒pET32a，重组子经双酶切、PCR和DNA序列分析鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株速殖子eDNA中扩增出316bp的Calpain-like基因片段；含pET32a／Calpain—like的重组质粒在宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物。结论成功地克隆和表达弓形虫RH株Calpain—like基因，弓形虫Calpain—like基因的克隆表达为进一步筛选弓形虫疫苗候选分子和治疗药物的靶位提供了研究基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因克隆、表达及其抗血清在食物中毒快速检测上的应用

目的克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因，制备金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）的多克隆抗体，应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的诊断。方法用核酸扩增技术从金黄色葡萄球菌菌株中分离产生肠毒素B的标准菌株，采用高保真PCR技术从金黄色葡萄球菌野生株中扩增全长SEB，目的片段经TA克隆后DNA序列测定，重组质粒pGEM—SEB经酶切获得的SEB基因片段与真核表达载体pGEX-4T-3连接，将重组真核载体pGEX-4T-3-SEB转化人E．coli BL21（DE3）株，在0．1mmol／LIPTG诱导下，诱导SEB基因在E-coli BL21（DE3）株中表达，用谷光苷肽Sepharose4B柱分离纯化GST融合蛋白，用SDS—PAGE检测重组SEB（rSEB）的表达，重组蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清，并用抗血清与天然的SEB和rSEB进行Westembolt分析。结果成功克隆了822bpSEB基因，编码272个氨基酸，在E．coli BL21（DE3）株中表达了rSEB，分离纯化的rSEB能够诱导小鼠产生IgG抗体，此抗体不仅能够与rSEB反应，而且能够与天然的SEB特异性的反应。结论重组SEB具有抗原特性，制备的特异性抗体可应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的快速诊断，将能够建立特异性强、敏感性高的金黄色葡萄球菌的诊断体系，同时也有助于对SEB在抗肿瘤机制、炎症过程中的作用等方面研究。     

基于SSUrRNA基因序列的间日疟原虫LAMP检测技术的建立

目的克隆分析间日疟原虫小亚基亚单位核糖体核糖核酸(SSUrRNA)特异性基因序列,建立间日疟原虫环介导等温扩增(LAMP)检测技术。方法针对间日疟原虫SSUrRNA种特异性基因序列设计1对引物,采用聚合酶链反应(PCR)从血样核酸提取物中扩增SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy载体连接,构建重组质粒并转化大肠埃希菌JM109,PCR与双酶切鉴定筛选阳性克隆并测序,设计6条寡核苷酸片段,LAMP检测感染血样中间日疟原虫DNA,扩增产物作琼脂糖电泳分析或直接荧光染色肉眼观察。结果间日疟原虫SSUrRNA基因扩增片段大小约为235 bp;阳性克隆重组质粒插入的SSUrRNA基因扩增片段含有235个核苷酸,与GenBank中的Sal-1株、Belem株间日疟原虫相同序列进行比对,同源性为100%,与PV2008/TR/DEL株、PVK1294株、E1 Salvador株的同源性均为99%,与三日疟原虫、卵形疟原虫及恶性疟原虫的序列同源性均低于95%。将含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以蒸馏水倍比稀释后做LAMP,试验的灵敏度为10 copy/μl;特异性检验显示间疟原虫患者血样DNA呈阳性反应,恶性...     

乙型脑炎病毒TaqMan逆转录聚合酶链反应检测方法的建立

目的采用TaqMan技术，研究建立实时荧光逆转录聚合酶链反应技术（RT—PCR）检测乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis，JEV）的效果。方法根据JEV非结构蛋白基因NS3基因序列（GenBank序列号，U15763），结合生物学软件序列比对分析，设计1对特异性引物和TaqMan寡核苷酸探针，优化荧光RT～PCR反应条件后，以模板梯度稀释法及相关毒株对比扩增检验测定方法的敏感度和特异性。结果引物和探针最佳浓度均为0．20uM，复性温度为55℃。方法至少检测出1 copy／止病毒RNA，与流感、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘等病毒均无交叉反应。从病毒核酸提取至完成检测仅需3hr左右。结论所建立的JEV病毒TaqMan荧光RT—PCR方法敏感特异，有助于JEV感染的实验室早期快速诊断。     

深圳市公明地区1994～2006年法定传染病流行特征分析

目的分析公明地区法定传染病流行特征，为新区政府制定传染病预防控制策略提供依据。方法对公明地区1994—2006年法定传染病甲乙丙类疫情报告资料进行描述性统计分析。结果疟疾发病呈明显下降趋势，淋病、肺结核、痢疾、病毒性肝炎发病率较高，梅毒、艾滋病发病率呈上升趋势，外来流动人口发病率较本地常住人口高，主要与流动人口存在高危行为有关。结论外来流动人口传染病防控是当前主要公共卫生问题，健康教育，行为干预等多项综合防治手段是预防控制传染病流行的有效措施。     

深圳市淡水鱼华支睾吸虫感染调查及实验研究

目的了解深圳市淡水鱼华支睾吸虫(肝吸虫)囊蚴感染情况,阻断和控制肝吸虫病在深圳市的传播和流行。方法用鱼体消化法筛查肝吸虫囊蚴;以肝吸虫过氧化物酶(SOD)基因保守序列作为摸板,RT- PCR鉴别肝吸虫囊蚴。结果对深圳市淡水鱼肝吸虫感染情况进行调查,共抽检16种鱼257份样品,其中检出肝吸虫囊蚴45份,检出率为17．50％。检出率最高的鱼种依次为鲩鱼40．74％、鲮鱼26％、鲤鱼22．5％、大头鱼 22．85％、生鱼16．6％、非洲鲫鱼14．5％;RT-PCR检测结果与镜检结果完全一致。结论检测结果显示深圳市淡水鱼中肝吸虫的感染情况严重,尤其是鲩鱼的感染率较高,为了控制和阻断肝吸虫的传播必须改变吃淡水鱼生的生活习惯。