福氏2a志贺菌MarA蛋白纯化复性及活性检测

目的 纯化、复性志贺菌MarA蛋白并分析其生物学活性.方法 将构建好的BL21大肠埃希菌工程菌经异丙基-β-D-硫代-乳糖苷(IPTG)诱导,His-tag形式表达MarA融合蛋白(约21ku),采用超声波破碎细菌,提取包涵体用高浓度尿素裂解,经镍柱亲和层析纯化,纯化后的蛋白质在小分子保护剂及还原型谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)的存在下对融合蛋白进行复性.用凝胶薄层扫描法测纯度.结果 从融合蛋白包涵体中获得纯度达90%以上的目的蛋白,免疫蛋白印迹试验结果显示,复性后的MarA融合蛋白能与抗福氏志贺菌抗体发生特异性结合.结论 成功建立有效纯化融合蛋白包涵体His-MarA的方法.     

福氏志贺菌主动外排基因acrA的克隆及原核表达

目的对福氏志贺菌外排基因acrA进行克隆和原核表达,为进一步研究其在志贺菌外排机制中的作用奠定基础。方法参考福氏志贺菌2aacrA基因序列设计一对特异引物,在引物的5′和3′端分别加入含有BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位点序列。以福氏志贺菌2a菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增acrA基因并与pMD18-T载体连接,然后转化DH5α。提取重组质粒pMD18-acrA,经BamHI/SalI双酶切并与载体pET30a连接后转化宿主菌BL21(DE3)pLys,通过IPTG诱导表达目的蛋白。结果克隆的acrA基因长度为1122bp,核苷酸序列与GenBank上公布的序列完全相同。原核表达经SDS-PAGE及WesternBlotting检测和鉴定,结果表明重组载体pET-30a-acrA可成功地在大肠杆菌中表达AcrA蛋白。结论成功构建了福氏志贺菌acrA基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中得到有效表达,该研究为了解AcrA蛋白的特性、功能以及对福氏志贺菌多药耐药机理的深入研究奠定了基础。