结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的 克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达.方法 采用热启动聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白.结果 经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0.6,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22.8%.结论 构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础.     

针对S基因的siRNA或shRNA表达框对HepG2.2.15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用比较

目的 化学合成针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA，同时制备针对相同区段的shRNA表达框，并比较二者对HepG2．2．15细胞中HBV基因表达和病毒复制的抑制作用。方法 化学合成针对HBVS基因的带有FITC标记的siRNA，设计合成带有FTrc标记的引物，PCR扩增含有RNA聚合酶Ⅲ启动子H1序列和shRNA编码序列的表达框，并对扩增产物进行纯化，将等摩尔数siRNA和shRNA表达框分别用脂质体转染稳定表达HBV的HepG2．2．15细胞，转染1d后流式细胞仪检测转染效率，转染3d后RT-PCR检测靶基因mRNA的水平，用SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测HBsAg的表达。收集转染前和转染后1、3、5和7d的细胞培养上清，检测HBsAg水平，同时用荧光定量PCR方法检测HBV　DNA的含量。结果成功制备了针对HBVS基因的shRNA表达框，将其与等摩尔数siRNA分别转染HepG2．2．15细胞后，RT-PCR证实细胞中HBV　mRNA水平降低，SDS-PAGE、Westem blot及间接免疫荧光染色检测到HBsAg的表达受到抑制，细胞培养上清中HBsAg和HBV DNA含量下降。与siRNA相比，shRNA表达框对HBV的抑制作用虽然起效较慢，但持续时间更长。结论shRNA表达框和siRNA均可明显抑制HBV的转录和表达，与siRNA相比，shRNA表达框能够更持久地抑制靶基因的表达。     

TTV核酸模板快速制备方法

目的 寻求建立适合大批量临床标本检测TT病毒（TTV）核酸快速制备方法,直接用于PCR扩增。方法 应用蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法与直接快速裂解法,分别制备TTV核酸做PCR模板,用于TTV的聚合酶链反应的快速检测。结果 在30例非甲－非庚型肝炎血清和50例慢性乙型肝炎患血清,应用经典的蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法和直接快速裂解法,分别制备TTV核酸模板,在相同条件下进行PCR扩增,结果两种制备方法的符合率为89％。结论 TTV是一种新发现的肝炎病毒,目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据,建立了具有快速、简便、适合大批量临床标本中TTV核酸制备方法,对TTV肝炎的快速诊断,具有重要的意义。     

Mohnarin2006——2007年度报告：西北地区细菌耐药监测

目的总结西北地区10家教学医院2006~2007年度临床分离病原菌的耐药状况。方法常规方法培养分离医院内感染病原菌,并应用半自动或全自动细菌鉴定分析仪鉴定到种,药敏试验方法按CLSI规定的标准进行。监测数据按卫生部全国细菌耐药监测(Mohnarin)中心设计方案的要求定期上报。采用WHONET5.4软件进行数据统计分析。结果西北地区10家教学医院共分离病原菌株14608株,其中革兰阴性菌10098株占分离菌的69.13%,革兰阳性菌4091株占分离菌的28.01%,真菌396株占分离菌的2.71%。大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶的产酶率为(1380/2021)68.28%,肺炎克雷伯菌产酶率为(455/1008)45.14%,大肠埃希菌对左氧氟沙星和环丙沙性的耐药率为63.00%~87.50%,铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌为32.90%~68.40%。革兰阳性球菌中耐甲氧西林的金葡菌的发生率为43.82%,耐甲氧西林的表葡菌的发生率为60.97%。未发现耐万古霉素的葡萄球菌。粪肠球菌对替考拉宁和万古霉素耐药率分别为3.20%、1.50%,屎肠球菌对替考拉宁和万古霉素耐药率分别为5.7%、3.2%。结论碳青霉烯类、哌拉西林/三唑巴坦、阿米卡星和头孢吡肟对医院内感染分离的肠杆菌仍有较好的抗菌活性,大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性越来越高,值得临床重视,应限制该类药物的临床应用范围。非发酵菌对临床常用抗菌药物普遍敏感性降低。耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素的屎肠球菌感染是抗菌药物治疗中的难点。临床微生物实验室应加强对产酶菌和多重耐药菌的监测,为临床正确合理使用抗菌药物提供依据。     

医院内感染病原菌的分布及耐药状况分析

目的：了解医院内感染病原菌的分布及耐药状况,为临床合理用药提供依据。方法常规培养分离鉴定,应用VITEKI和phoenix100全自动细菌鉴定分析仪系统鉴定菌株;药敏试验采用K-B纸片扩散法,根据CLSI规定的标准进行。结果2013年共检出6681株病原菌,临床分离的细菌主要以革兰阴性菌为主,大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌为分离菌株的前五位,分离率分别为17.2%、14.19%、13.31%、12.26%、9.52%,产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分离率分别为56.94%、41.53%;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分离率为59.18%。检出耐万古霉素、耐利奈唑胺的金黄色葡萄球菌各1株。结论大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球仍是临床院内感染的重要病原菌,且对多种抗生素都处于比较高水平的耐药率,有逐年升高的趋势。临床微生物实验室应加强医院内重要感染病原菌的耐药性检测,临床应根据药敏结果和患者自身的感染状况制定出合理的个性化治疗方案,并高度重视多药耐药菌感染者的有效隔离,以防控耐药菌的扩散和流行。     

FBN1基因c.4336G>A突变导致35号外显子缺失可能引发马方综合征

目的探究1例马方综合征家系的遗传学病因及检出突变c.4336G>A对原纤维蛋白-1(FBN1)基因剪接效应的影响。方法对2019年8月就诊于空军军医大学西京医院心血管外科的1例胸主动脉夹层动脉瘤患者, 采用多重PCR联合二代测序技术对其进行遗传性主动脉疾病相关的15个基因的组合检测, 应用Sanger测序技术对检出位点进行验证并对部分家庭成员进行同一位点的检测。通过剪接预测软件预测该突变位点对剪接的影响, 并提取正常人及患者新鲜外周血中RNA, 通过逆转录PCR及Sanger测序, 验证突变对剪接过程的影响。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)遗传变异分类标准与指南分析检出位点的致病性。结果基因组合检测结果显示先证者携带有FBN1基因杂合变异c.4336G>A, Sanger测序结果与二代测序结果一致。Sanger测序对部分家庭成员检测发现, 该家系中还存在4名携带者, 其中3例已出现胸主动脉瘤或夹层的表现;dbscSNV_ada_score 和dbscSNV_rf_score预测检出位...     

G6PC基因复合杂合突变致糖原累积病Ⅰa型1例

糖原累积病(GSD)是糖原和脂质在肝、肾内异常累积导致的以肝脏和肾脏肿大为特点的一种常染色体隐性遗传病,其中Ⅰ型 GSD 最为多见,发病率为1/20 万～1/10 万.Ⅰ型 GSD又称 von Gierke病,主要包括Ⅰa 和Ⅰb 两种亚型,Ⅰa 型为葡萄糖-6-磷酸酶缺乏症,Ⅰb 型为葡萄糖-6-磷酸转移酶缺陷[1].患儿常因罹患与年龄不符的疾病而就诊,如高尿酸血症所致痛风、高脂血症所致急性胰腺炎,甚至以低血糖昏迷、乳酸酸中毒等急性并发症就诊,但由于Ⅰ型GSD发病率低,首发症状非特异,确诊方法复杂,故易造成误诊、漏诊[2-5].随着基因测序技术在临床逐步开展,GSD的确诊方法由过去有创的肝脏组织活检更新为无创的基因检测,有效提高了该病的诊断率[6].现报道笔者临床检验工作中发现的 GSDⅠa 型合并先天性心脏病 1 例.     

链霉亲和素-自噬相关基因融合蛋白的原核表达及纯化

目的 构建链霉亲和素（streptavidin,SA）和自噬相关基因（Beclin 1）重组质粒,并对融合蛋白SA-Beclin 1进行表达和纯化.方法 利用基因重组技术将核心SA与Beclin 1序列连接,克隆人pQE80形成pQE80-SA-Beclin 1重组载体,IPTG诱导融合蛋白原核表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blot鉴定.结果 PCR成功扩增核心SA活性中心,酶切鉴定和测序均证实重组载体pQE80-SA-Beclin 1构建成功;IPTG诱导后SA-Beclin 1融合蛋白（含His标签）在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE分析表达的融合蛋白以包涵体为主,经镍亲和凝胶层析柱纯化得到融合蛋白,Western blot鉴定其相对分子量约为72000kD,与预期相符.结论 本文成功构建了重组质粒并表达纯化了SA-Beclin 1融合蛋白,为进一步研究SA-Beclin 1的功能及临床应用奠定了基础.     

志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立

目的 建立快速检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR方法.方法 根据志贺菌ipaH基因、沙门菌ipaB基因及霍乱弧菌EPSM基因设计特异性PCR引物,加热煮沸法制备DNA模板,进行PCR扩增及琼脂糖电泳检测.结果 应用所建立的多重PCR方法能分别或同时快速、特异地检测出志贺菌606bp、沙门菌314bp和霍乱弧菌482bp的目的基因.结论 初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系,可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断.     

人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因在CHO细胞中的表达

目的获得人杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)N端活性片段蛋白,为BPI结构和功能的研究提供有力的工具。方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPIN端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染CHO细胞并筛选阳性克隆,免疫荧光法鉴定重组BPI的表达和免疫学活性。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,与文献报道的序列相比,有6个核苷酸差异。转染筛选的阳性CHO细胞克隆表达产物能够被抗BPI的单克隆抗体所识别。结论BPI活性片段表达载体的构建及真核表达成功,为BPI功能的研究奠定了基础。