云南省华宁县荒川库蠓形态和遗传多态性研究

目的了解云南省荒川库蠓形态多样性及遗传多态性。方法 2015年7月在云南省华宁县采集库蠓样本,制备压片进行形态学鉴定,同时提取基因组DNA,用细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因和间隔区-1(ITS-1)基因特异引物进行PCR扩增和序列测定,采用Clustal X、DNAStar和Mega 6.1等软件进行核苷酸同源性和遗传进化分析。结果共采集到库蠓955只,其中12只库蠓在R1和R2室下端多出1个淡斑,翅面共有15个淡斑;另外943只库蠓翅面有14个淡斑。对12只翅面有15个淡斑的库蠓(A组)和14只翅面有14个淡斑的库蠓(B组)进行形态学和分子生物学鉴定,26只库蠓均具有两复眼分离、小眼面间无柔毛、触角第15节无嗅觉器、1个大梨形受精囊、翅面有小圆形淡斑的形态学特征。两组库蠓的HR和TR2值差异有统计学意义(P0.05),而AR、PR、CR和TR1、TR3值的差异均无统计学意义(P0.05)。COⅠ基因和ITS-1基因遗传进化分析显示26只库蠓与荒川库蠓亲缘关系最近;但是在COⅠ基因进化树上26只库蠓分为明显的两个进化簇,其中14只库蠓(B组)形成1个单独的进化簇,与另一进化簇核苷酸同源性在94%以下。结论云南省华宁县除了荒川库蠓外,还存在1种翅面有形态差异的变种库蠓以及COⅠ基因序列差异较大的荒川库蠓,提示该地区荒川库蠓的形态学和遗传学具有多态性。     

云南省江城县嗜蚊库蠓形态和分子生物学鉴定

目的 用形态学和分子生物学相结合的方法系统鉴定在江城县采集的库蠓,明确其分类。方法 2015年用诱蚊灯在云南省江城县牛圈采集库蠓,提取蠓虫基因组DNA,用PCR扩增细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因,测序,用Mega X软件进行遗传进化分析。同时对库蠓虫体进行压片,观察其形态特征。结果 在江城采集的库蠓JC12-3两复眼相连,触角第3、11～15节分布有嗅觉器,触须第3节无明显感觉窝,大颚齿15枚;翅面共有淡斑5个,径5室端部翅缘有1条宽淡色带向下延伸到中1室,中1室和中2室各有1条窄的淡色条带;腹部有3个发达不等大受精囊等形态特征。COⅠ基因序列分析显示,JC12-3与嗜蚊库蠓位于同一个进化分支内,它们之间的遗传距离为1.96%,小于嗜蚊库蠓种内最大遗传距离3.88%,而与其他三囊亚属库蠓位于不同进化分支,它们之间遗传距离均高于17%。结论 经形态学和分子生物学鉴定,明确了库蠓JC12-3为嗜蚊库蠓,这是云南省江城地区首次报道采集到该库蠓,丰富了该地区库蠓种类资源,为云南省蠓虫分类及蠓传疾病监测和研究提供了鉴定依据。     

云南省师宗县牛羊蓝舌病病毒感染情况及活动规律监测

目的 研究蓝舌病病毒近几年在云南省师宗县的感染情况及活动规律。方法 2014-2016年连续3年在师宗县设置监控点,每年选择蓝舌病抗体阴性的10头牛和5只羊作为监控动物,5-10月每周采血1次,11月、12月,每月采血1次,每次每头动物采集常规全血、肝素抗凝血各1份,用于蓝舌病抗体检测和病毒分离。结果 2014-2016年均有动物感染蓝舌病病毒,平均感染率为35.56%,感染时间均在6-10月之间,这一结果表明蓝舌病病毒感染动物主要集中在每年的6-10月,这一时期应加强蓝舌病的防控。在蓝舌病监测中,45只监控动物中的16只感染了蓝舌病病毒,并从7只感染动物中分离出9株蓝舌病病毒,分别为BTV-2、-4、-9、-12、-16型,其中BTV-16型4株,为优势血清型。结论 病毒分离和鉴定结果表明,师宗县长期存在多种血清型蓝舌病病毒。     

西昌市虫媒病毒核酸检测及其序列分析

目的了解四川省西昌市蚊虫样本中虫媒病毒的流行情况, 丰富四川省西南部地区虫媒病毒的活动规律和病毒遗传特征的研究数据。方法 2018年6月对采集自西昌市3个村不同猪圈环境中的三带喙库蚊提取核酸, 使用云南环状病毒属、版纳病毒属、西藏环状病毒属(S7、S10)、黄病毒属、甲病毒属的特异性引物进行PCR检测, 对阳性产物克隆测序并进行序列分析。结果共采集到蚊虫9 012只, 其中三带喙库蚊为优势蚊种, 对采集到的三带喙库蚊分88批次进行扩增, 分别检测出2株乙型脑炎病毒(JEV)、7株版纳病毒(BAV)、7株西藏环状病毒(TIBOV)和1株云南环状病毒(YOUV), 序列分析结果显示, 17株新检测病毒株均与云南分离株遗传关系接近, 2株JEV位于GⅠ-b进化支;7株BAV为A2进化分支;7株TIBOV中, 6株位于同一进化支;1株TOUV与云南分离株在同一进化支。结论西昌市的三带喙库蚊中存在携带JEV、BAV、YOUV及TIBOV等病毒的可能, 其中JEV为GⅠ-b型病毒, BAV为A2型, 为西昌市虫媒病毒的检测及分析提供了数据支持。     

云南省江城县苏岛库蠓形态学和分子生物学鉴定

目的采用形态学和分子生物学方法对在云南省江城县采集的库蠓进行鉴定,明确该库蠓的准确分类。方法2017年9月在云南省江城县采集蠓虫样本,采用不损伤库蠓形态的方法提取基因组DNA,用COⅠ基因和ITS-1基因特异引物进行PCR扩增和序列测定,采用Clustal X、DNAStar和Mega 6.1等软件进行核苷酸同源性和系统进化分析。同时将库蠓虫体压片,在体视显微镜下进行形态学鉴定,并计算AR、HR、PR、CR和TR1、TR2、TR3等数值。结果在江城县采集15只库蠓,均具有两复眼相连接,小眼面间无柔毛,触角15节,第3、11~15节分布有嗅觉器,翅面翅基、径中、径端、径5室、中4室各有1个淡斑,中1室、中2室分别有2个和3个淡斑,其中基淡斑大,向后延伸至臀室基部翅缘;腹部有2个发达受精囊不等大,PR=3.10±0.48,与苏岛库蠓PR值差异无统计学意义(t=1.79,P>0.05)。遗传进化分析显示,在ITS-1基因进化树上江城县采集的15只库蠓与苏岛库蠓位于同一分支内,核苷酸同源性在96.8%~99.3%之间,而与其他库蠓核苷酸同源性均低于94.2%;在COⅠ基因进化树上15只库蠓形成一个独立进化簇,这15只库蠓核苷酸同源性在99.4%以上。结论 15只江城采集的库蠓均为苏岛库蠓,其种内变异较小。本研究增添了苏岛库蠓种类鉴定所需要ITS-1基因和COⅠ基因序列,为库蠓快速鉴定和遗传进化研究提供了序列信息。     

云南省通海县蚊虫2株乙型脑炎病毒的分离鉴定北大核心CSCD

目的了解云南省通海县蚊虫携带的乙型脑炎病毒(JEV)情况、分子特征及基因分型。方法2015年7月在云南省玉溪市通海县采用诱蚊灯在调查点通宵捕捉蚊虫,蚊虫研磨后分别接种BHK-21和C6/36细胞进行病毒分离,使用黄病毒属特异引物进行初步鉴定,使用乙型脑炎病毒E基因特异引物进行RT-PCR扩增及测序,使用Megalign、Genedoc、Mega7等软件进行序列分析。结果共捕获三带喙库蚊、中华按蚊、致倦库蚊和骚扰阿蚊2300只,其中三带喙库蚊为优势蚊种(78%)。分46批进行病毒分离,获得2株阳性分离物,接种BHK-21细胞96h,引起细胞病变。使用黄病毒属特异引物和乙型脑炎病毒E基因特异引物扩增均为阳性。序列分析结果显示,2株新分离乙型脑炎病毒与疫苗株SA14-14-2在E基因存在12个氨基酸差异位点,在8个与乙脑病毒毒力相关的位点上存在6个差异位点。E基因遗传进化分析显示,2株新分离病毒与基因Ⅰ型乙型脑炎病毒位于同一进化分支,核苷酸和氨基酸同源性分别为91.8%~99.1%和98.0%~100%。遗传进化分析显示,其与云南2016年蚊虫中分离的乙脑病毒株JEV/mosq/YN/2016亲缘关系较近,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.1%和99.8%。结论云南省通海县分离的2株病毒鉴定为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒,其与云南省近年来流行的毒株遗传进化关系较近。2毒株的E基因上与毒力相关的关键位点中有2个位点发生突变,结构域Ⅲ的关键抗原未发生改变,因此SA14-14-2减毒疫苗株仍可用于该地区人群的免疫接种,以预防乙型脑炎的发生和流行。     

1株2019年云南省西双版纳流行登革热1型病毒全基因组序列分析

目的了解2019年西双版纳暴发登革热主要流行血清型登革热1型病毒(Dengue virus-1,DENV-1)分子特征,为当地登革热流行的预防控制提供依据。方法在C6/36细胞上对1株从2019年西双版纳发热患者血液中分离到的DENV-1病毒(JHS45)进行复壮,采用二代测序的方法对该株病毒进行测序,采用CLC Genomics workbench 8.0生物信息学软件对测序数据组装,使用Lasergene软件、MEGA6.1等进行序列比对、系统进化树构建及氨基酸位点分析。结果JHS45株病毒在C6/36细胞上6 d出现细胞病变。测序组装后获得JHS45株病毒1条10687个核苷酸(nt)长序列(GeneBank登录号:OR593353)。遗传进化分析结果JHS45株病毒与我国2019年西双版纳、广州、河南、浙江流行的以及2013年泰国流行的DENV-1基因型Ⅰ病毒形成一个进化分枝,核苷酸同源性为97.6%~99.9%,氨基酸同源性为99.1%~100%;分析发现与2019年云南西双版纳(MW386863)和广州(MW261839)流行的DENV-1基因型Ⅰ病毒位于同一个较小的进化分枝,它们之间同源性最高,核苷酸同源性均为99.9%,氨基酸同源性均为100%;JHS45株病毒与2015年以来西双版纳流行的DENV-1进行氨基酸差异位点分析,在JHS45株病毒编码区共存在40个氨基酸差异位点,主要集中在非结构蛋白的NS3区域和NS5区域。结论全基因序列分析结果显示JHS45株病毒为DENV-1基因型1病毒,该次西双版纳登革热疫情与西双版纳、广州、河南、浙江流行的病毒株遗传进化关系比较密切,为云南省乃至我国的登革热疫情监测、病毒进化研究以及防控策略制定提供科学依据。